茄非食部分生物堿提取液抑菌活性研究

劉艷芳 - 張德欣 - 丁寅寅 -

(阜陽職業技術學院，安徽 阜陽 236031)

茄(SolanummelongenaL.)，別名茄子、矮瓜、吊菜子、落蘇、青茄、紫茄、白茄，是茄科茄屬一年生草本植物。研究[1]發現：茄中含有有機酸、酚類、皂苷、鞣質、生物堿等多種生物有效成分。其中，生物堿是一類來源于生物界(以植物為主)的含氮有機化合物，是植物體內的一類次生代謝產物，多數生物堿分子具有較復雜的環狀結構，且氮原子在環狀結構內，呈現堿性。生物堿生物活性具有多樣性的特點，對人體有一定保健作用。研究[2]發現，生物堿是茄子中最有效的成分之一，具有平喘、鎮痛、抗癌、降壓等多種功效。

近年來，安全、天然的功能性食品防腐劑受到越來越多人的青睞，而生物堿正是植物體內天然存在的原有抗菌物質，被稱為phytoanticipins，它對食品中常見的腐敗菌具有抑制作用，是一種良好的天然抑菌劑[3]，是發展安全、高效、廣譜、環保的天然食品保鮮劑、防腐劑的潛在資源。目前，對生物堿的研究及利用在國內外都引起了普遍重視。蔡亞東等[4]研究表明，龍葵、蒲公英提取物對番茄早疫病原菌、黃瓜黑星病原菌、辣椒絲核病原菌、黃瓜枯萎病原菌4種病原菌有一定抑菌作用；郭紫娟等[5]研究了不同提取條件下無花果中活性物質的抑菌作用，結果表明，無花果干水提物對真菌具有較好的抑制作用，乙醇提取物具有良好的廣譜抑菌作用；多甜甜等[6]研究了馬鈴薯糖苷生物堿的抑菌活性，結果表明，馬鈴薯糖苷生物堿提取液對供試真菌均具有一定的抑菌活性，以對腐皮鐮刀菌的抑制效果最佳。諸如此類的研究多見于茄科植物番茄、馬鈴薯、龍葵等，而有關茄生物堿的研究，僅僅集中于果實中生物堿的分離純化[7-8]，未見茄非食部分生物堿抑菌作用的研究報道。為了更好地探究茄非食部分生物堿提取液抑菌作用，本研究以食品中9種常見污染菌作為供試菌種，進行抑菌活性及抑菌穩定性探討，旨在為后續茄非食部分生物堿天然新型食品防腐劑的研究開發提供理論依據，并為茄廢棄部分的綜合開發利用、變廢為寶提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干燥的茄非食部分待測混合樣品(包括茄子的根、莖、葉、蒂)：豐寶紫紅茄，安徽省阜陽市潁泉區繼源蔬菜種植專業合作社。將收集到的茄非食部分室外自然晾干后，于60 ℃ 烘干，高速粉碎，過45目篩(孔徑0.355 mm)，得到茄非食部分粉末，用PVC/PE復合膜包裝，4 ℃冰箱冷藏，備用。

75%乙醇、氯化鈉、檸檬酸、蔗糖、碳酸氫鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、普通變形桿菌(P.vulgaris)、沙門氏菌(salmonella)、假絲酵母(Candidaalbicans)、啤酒酵母(Sac-charomycescerevisiae)、青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillusnige)：上海魯微科技有限公司；

牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、瓊脂粉20 g、NaCl 5 g、水1 000 mL、pH 7.2～7.4，用于細菌培養；

馬鈴薯培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL、自然pH，用于酵母菌、霉菌培養。

1.1.2 主要儀器與設備

高壓滅菌鍋：WDZX-200KC型，上海申安醫療器械廠；

超凈工作臺：ACB-4A1型，北京晨曦勇創科技有限公司；

超聲清洗器：HD3100型，德國Bandelin公司；

旋轉蒸發儀：RE5203型，上海比朗儀器制造有限公司；

生化培養箱：SPX-150型，無錫沃信儀器制造有限公司；

高速粉碎儀：ST-G100型，北京旭鑫儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茄非食部分生物堿提取液的制備 取茄子非食部分干燥粉末100 g，用1 000 mL 75%乙醇溶解，35 ℃超聲波(功率800 W)浸提40 min，抽濾，濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，用3%檸檬酸溶液調節浸膏pH值至2～3，過濾，濾液用Na2CO3調節pH至10.5，產生粗生物堿沉淀，20 ℃ 8 000 r/min 離心40 min，棄去上清液，用氮吹儀吹干沉淀后，將其溶于10 mL無水乙醇，即得到茄非食部分生物堿提取原液，按兩倍稀釋法，依次得到其他濃度的懸浮液[9-10]。

1.2.2 菌種的活化、菌懸液的制備 將各供試菌種接入相應試管斜面進行活化培養(細菌培養條件為：37 ℃、24 h；酵母菌、霉菌培養條件為：28 ℃、48 h)[11]。分別用接種環挑取一環各活化好的供試菌體于裝有少量無菌水的試管內，震蕩搖勻、稀釋，制成菌懸液(含菌量為1.0×108CFU/mL)，備用。

1.2.3 茄非食部分生物堿提取液抑菌試驗 采用濾紙片法[12]，分別移取200 μL 1.2.2中各菌懸液于平板上，用涂布棒涂布均勻。將制備好的直徑7 mm的無菌濾紙片浸入茄非食部分100%生物堿提取原液中30 min后，取出貼于平板表面，每種供試菌種做3次平行試驗。因考慮到山梨酸鉀具有良好的防霉性能，能對霉菌、酵母菌和好氣性細菌的生長發育起抑制作用，是大多數國家使用最多的防腐劑，且食品防腐劑大多水溶性較差，但在乙醇中有良好的溶解性，乙醇組分單一、價格低廉，在科研和生產中要使食品防腐劑在介質中均勻擴散，大多情況下以乙醇作為溶媒使用。鑒于上述原因，本試驗研究以浸入0.5%山梨酸鉀溶液的濾紙片作陽性對照，以無水乙醇作陰性對照(以上均為無菌操作)。在適宜條件下培養后，測定并計算供試菌及對照組的平均抑菌直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的確定 采用兩倍稀釋法。以無水乙醇作為溶劑，將茄非食部分生物堿提取液按照一定濃度梯度配制成系列溶液，加入已融化的培養基中，均勻混合，使培養液中提取液濃度分別為0.391%，0.782%，1.563%，3.125%，6.250%，12.500%，25.000%，50.000%。待培養基凝固后，接種各供試菌種，適宜條件下培養并觀察菌體生長情況[13]。以無水乙醇作為空白對照。判斷標準：肉眼觀察無菌生長的培養基中提取液濃度最低者，即為茄非食部分生物堿提取液的最低抑菌濃度。

1.2.5 茄非食部分生物堿提取液的抑菌穩定性試驗 各種抑菌物質抑菌效果均受介質狀態、加熱程度(熱敏性)、pH值(耐酸堿性)、紫外光照射(光敏性)、糖鹽濃度等因素的影響。

(1) 熱處理對生物堿提取液抑菌穩定性的影響：將茄非食部分生物堿提取液分別置于40，60，80，100 ℃水浴及121 ℃ 濕熱條件下處理30 min，用未經熱處理的茄非食部分生物堿提取液作為對照，以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉作為指示菌，采用濾紙片法，測定熱處理后各樣品的抑菌能力[14]。

(2) 介質pH值對生物堿提取液抑菌穩定性的影響：用10%的NaHCO3和10%的檸檬酸分別將茄非食部分生物堿提取液配制成8個pH值梯度的溶液：3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0。以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉作為指示菌，采用濾紙片法[15]，測定不同pH值條件下茄非食部分生物堿提取液抑菌能力。

(3) 不同紫外光線照射對生物堿提取液抑菌穩定性的影響：將茄非食部分生物堿提取液在20 W 254 nm紫外燈光下，相距30 cm處分別照射5，10，20，30，40，60 min。用未經紫外光線照射的茄非食部分生物堿提取液作為對照，以金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉作為指示菌，采用濾紙片法，測定不同時間紫外光線處理后茄非食部分生物堿提取液抑菌能力的變化。

(4) 糖濃度對生物堿提取液抑菌穩定性的影響：配制蔗糖濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g/mL的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯培養基(細菌培養使用牛肉膏蛋白胨培養基；酵母菌、霉菌培養使用馬鈴薯培養基)，以不加蔗糖的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯培養基為對照，將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉作為指示菌，采用濾紙片法，測定不同蔗糖濃度條件下，茄非食部分生物堿提取液抑菌能力的變化[16]。

(5) 鹽濃度對生物堿提取液抑菌穩定性的影響：配制NaCl濃度分別為0.006，0.008，0.010，0.012，0.014 g/mL的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯培養基，以不加NaCl的牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯培養基為對照，將金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉作為指示菌，采用濾紙片法，測定不同蔗糖濃度條件下，茄非食部分生物堿提取液抑菌能力的變化。

2 結果與分析

2.1 茄非食部分生物堿提取液的抑菌效果

由表1可知，茄非食部分生物堿提取液對各種供試酵母菌、霉菌、細菌都有良好的抑制作用，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、啤酒酵母、黑曲霉、沙門氏菌均有明顯的抑菌作用，其中假絲酵母、啤酒酵母的抑菌圈直徑最大，分別高達(28.63±0.42)，(34.83±0.48) mm。另外，茄非食部分生物堿提取液的抑菌作用與0.5%山梨酸鉀溶液抑菌作用相比較，前者有顯著性優勢。陶永霞等[17]研究了番茄生物堿粗提物對食品中常見腐敗菌的抑菌效力，發現它對細菌和酵母菌具有較強的抑制作用，但對霉菌的抑菌作用較弱；尚天翠[18]采用MIC和紙片法考查了曼陀羅提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌性能，結果表明，曼陀羅對4種受試菌株都有抑菌活性，pH值為8時，曼陀羅水提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌性最好。以上研究結果與本試驗基本一致。

2.2 茄非食部分生物堿提取液對各種供試菌的最低抑菌濃度(MIC)

茄非食部分生物堿提取液對各種供試菌的MIC，采用兩倍稀釋法進行測定。由表2可知，茄非食部分生物堿提取液對假絲酵母、啤酒酵母的最小抑菌濃度最低，MIC為6.250%；對枯草芽孢桿菌、黃色葡萄球菌、沙門氏菌、黑曲霉的最小抑菌濃度其次，MIC為12.50%；而對大腸桿菌、普通變形桿菌、青霉的最小抑菌濃度最高，MIC為25.00%。最小抑菌濃度的大小進一步反映出茄非食部分生物堿提取液對各種供試菌的抑菌效力，MIC越低，抑菌效力就越強，即該生物堿提取液對酵母菌的抑菌效果最顯著，與濾紙片法測定出的抑菌效果一致。

2.3 茄非食部分生物堿提取液的抑菌穩定性

2.3.1 熱處理對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響 由圖1可知，茄非食部分生物堿提取液經不同溫度處理30 min后，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉4種指示菌的抑菌效果產生了一定的影響，且抑菌效果的變化趨勢基本相同：當提取液的加熱溫度低于100 ℃時，抑菌效果穩定性良好，其中當加熱溫度低于60 ℃時，抑菌效果穩定性顯著，抑菌圈基本無變化；當加熱溫度在60～80 ℃時，4種指示菌的抑菌圈略有縮小，但不顯著；隨著加熱溫度繼續升高至121 ℃時，茄非食部分生物堿提取液對4種指示菌的抑菌效果顯著降低，表現為抑菌圈直徑大幅度降低，但仍能表現出一定的抑菌作用。這可能是高溫加熱處理使該生物堿提取液中的抑菌成分產生了化學變化，從而導致其抑菌活性降低；亦或是高溫使部分活性成分揮發，導致其抑菌活性降低[19-20]。

表1 茄非食部分生物堿提取液對食品中常見污染微生物的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activities of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant against common spoilage microorganisms in food (n=3) mm

表2 不同濃度的茄非食部分生物堿提取液對食品中常見污染微生物的最低抑菌濃度?Table 2 MICS of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant with different concentrations against common spoilage microorganisms in food

? +++表示微生物大量生長；+表示微生物生長；-表示無微生物生長。

圖1 熱處理對茄非食部分生物堿提取液 抑菌穩定性的影響

Figure 1 Effect of heat treatment on antimicrobial activity of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant

2.3.2 介質pH值對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響 由圖2可知，pH值對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響存在差異：當pH值為7.0時，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、黑曲霉的抑菌作用最強，表現為抑菌圈直徑最大；當pH值為8.0時，對啤酒酵母的抑菌作用最強，抑菌圈直徑最大。且茄非食部分生物堿提取液抑菌效果隨著pH值的變化，呈現拋物線形態，酸性或堿性越強，抑菌效能越差，抑菌圈直徑越小。其原因可能是有效生物堿抑菌成分處于強酸、強堿條件時，質構發生了變化，從而使其抑菌能力降低[21]。

圖2 pH對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響

Figure 2 Effect of pH value on antimicrobial activity of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant

2.3.3 紫外線照射時間對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響 由圖3可知，當紫外線照射處理時間在30 min以內時，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、啤酒酵母、黑曲霉4種指示菌的抑菌圈直徑無顯著變化，抑菌活性基本無改變；超過30 min后，抑菌圈直徑大幅減少，抑菌效果顯著降低，但仍能表現出一定的抑菌作用。這可能是紫外線照射使部分提取液抑菌活性物質的結構發生了變化，導致抑菌活性降低[22]。

圖3 紫外線照射時間對茄非食部分生物堿提取液抑菌 穩定性的影響

Figure 3 Effect of UV irradiation on antimicrobial activity of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant

2.3.4 糖濃度對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響 由圖4可知，隨著培養液蔗糖濃度的增高，茄非食部分生物堿提取液抑菌作用總體呈現上升趨勢。當培養液中蔗糖濃度在0.02～0.04 g/mL時，4種指示菌的抑菌圈直徑無顯著變化，說明低濃度的蔗糖對提取液抑菌活性的影響不顯著；0.04～0.08 g/mL時，抑菌圈直徑明顯增大，抑菌效果顯著增強；0.08～0.10 g/mL時，抑菌圈直徑無明顯變化，穩定在高抑菌狀態。這可能是蔗糖濃度達到一定程度，其本身會產生一定的滲透壓，能協同抑制微生物的生長[23]。

圖4 糖濃度對茄非食部分生物堿提取液抑菌 穩定性的影響

Figure 4 Effect of saccharose on antimicrobial activity of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant

2.3.5 NaCl濃度對茄非食部分生物堿提取液抑菌穩定性的影響 由圖5可知，隨著培養液中NaCl濃度的增高，茄非食部分生物堿提取液抑菌效果有所增強。當培養液中NaCl濃度在0.006～0.008 g/mL時，4種指示菌的抑菌圈直徑無明顯變化，即對抑菌活性影響不顯著；0.008～0.012 g/mL時，抑菌圈直徑顯著增大，抑菌效果顯著增強；0.012～0.014 g/mL 時，抑菌圈直徑基本保持不變，抑菌效果穩定在較高水平。這可能是NaCl也會產生一定的滲透壓，其濃度增加會增強提取液的抑菌效果[24-25]。

圖5 NaCl濃度對茄非食部分生物堿提取液抑菌 穩定性的影響

Figure 5 Effect of sodium chloride on antimicrobial activity of alkaloid extract from inedible parts of the eggplant

3 結論

本試驗以食品中9種常見污染菌作為供試菌種，研究了茄非食部分生物堿提取液的抑菌活性，同時研究了不同條件下該生物堿提取液的抑菌穩定性[26]。結果表明，茄非食部分生物堿提取液對9種供試菌均具有良好的抑菌效能，抑菌效果優于傳統化學防腐劑山梨酸鈉；條件不同，提取液抑菌能力具有差異性，當溫度低于100 ℃，pH 值6～8，紫外照射處理時間小于30 min，糖濃度在0.08～0.10 g/mL，NaCl濃度在0.012～0.014 g/mL時，抑菌穩定性較好。

茄子在中國各地均有大量種植，而茄非食部分作為廢棄物，未得到科學合理的運用。本試驗的研究證實，茄非食部分生物堿活性成分具有高效廣譜抑菌作用，是一種良好的天然抑菌劑。這為后續茄非食部分生物堿天然食品防腐劑的開發研究提供依據，繼而開辟茄非食部分綜合開發利用的新途徑。

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