祁白術生物活性物質及其抗氧化、抑菌能力研究

吳永祥 - 江海濤 - 崔 朋

方建新1FANG Jian-xin1 王衛(wèi)東3WANG Wei-dong3 胡長玉1HU Chang-yu1

祁白術簡稱祁術，為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz·)的干燥根莖，因僅野生分布于安徽祁門及附近地區(qū)而得名。祁白術在當地民間被視為珍貴補品，適宜于久病體虛者和小兒體虛者進補，藥效持久，補而不膩[1]。李云志等[2-3]采用HPLC-ESI-TOF/MS快速分離鑒別了野生祁白術的化學成分，表明野生祁白術與栽培白術具有不同的藥效物質基礎。祁白術的道地性及優(yōu)良品質可能與當地地質、氣候、土壤、生物等生態(tài)環(huán)境因素作用有關[4-5]。白術含有揮發(fā)油、多糖、黃酮類、內酯類化合物、苷類等生物活性成分[6-8]，具有抑菌[9]、抗腫瘤[9]、抗炎癥[10]、調節(jié)脂質代謝[11]及改善學習記憶、延緩衰老[12]等功效。本課題組前期研究了祁白術的營養(yǎng)成分及多糖提取工藝，表明祁白術除可作為藥用外，還能應用于功能性食品的開發(fā)[13-14]。目前國內外學者對于白術化學成分及功效的研究都是基于栽培白術[7,9,11-12]，對祁白術不同極性萃取相抗氧化和抑菌作用的研究仍然缺乏，主要活性成分的分析與鑒定尚未見報道。

本試驗擬對祁白術醇提物及其不同極性萃取相的總酚、總黃酮含量及抗氧化、抑菌活性進行研究，考察總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性，并采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析醇提物中的主要化學成分，旨在闡明道地藥材——祁白術的藥效物質基礎，同時為祁白術資源在食品、藥品領域的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

祁白術：2017年8月于安徽省祁門縣古溪鄉(xiāng)采集，經除雜、清洗后，將60 ℃烘干至恒重的祁白術粉碎成粉末，過80目篩，干燥保存。

2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、單寧酸(tannic acid, TA)、槲皮素(quercetin, QE)、抗壞血酸(Vitamin C, Vc)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben, PP)：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：生物試劑，北京陸橋技術有限責任公司；

所有分離用有機溶劑：分析純，南京化學試劑有限公司；

大腸桿菌(E.coli, G-)、綠膿桿菌(P.aeruginosa, G-)、金黃色葡萄球菌(S.aureus, G+)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis, G+)：武漢大學微生物保藏中心。

1.1.2 主要儀器設備

生化培養(yǎng)箱：SPX-100A型，上海仙象儀器儀表有限公司；

超凈工作臺：DL-CJ-1N型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZF-75KB-III型，上海申安醫(yī)療器械廠；

全波長酶標儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：Agilent HP7890-5975C型，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 祁白術甲醇粗提物及各萃取相的制備 取祁白術粉末20 g，按照料液比1∶10 (g/mL)與甲醇溶液混合，60 ℃恒溫回流提取3 h，過濾后收集上清液，剩余殘渣再按照上述條件提取2次，合并3次上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮得祁白術甲醇粗提物5.51 g。將甲醇粗提物混懸于蒸餾水中，按1∶1體積比依次加入正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，每相萃取3次，分別得到正己烷相0.74 g、二氯甲烷相0.29 g、乙酸乙酯相0.11 g、正丁醇相0.76 g 以及剩余的水相3.47 g。按式(1)計算祁白術各萃取相的提取率。

(1)

式中：

R——提取率，%；

Wf——各萃取相的提取量，g；

We——甲醇粗提物的提取量，5.51 g。

1.2.2 總酚含量測定 采用福林酚法[15-16]。以標準品單寧酸濃度C為橫坐標，吸光值Y為縱坐標，繪制標準曲線方程Y=0.002 2C+0.003 4，R2=0.999。單寧酸在50～250 μg/mL時與吸光度呈良好線性關系。根據上述標準曲線計算祁白術甲醇粗提物及各萃取相中的總酚含量，結果以每克樣品中含有相當單寧酸毫克數表示，即mg TA/g。

1.2.3 總黃酮含量測定 采用鋁鹽顯色法[17]。以標準品槲皮素濃度C為橫坐標，吸光值Y為縱坐標，繪制標準曲線方程Y=0.025 9C-0.015 7，線性范圍20～100 μg/mL，R2=0.996。根據上述標準曲線計算祁白術甲醇粗提物及各萃取相中的總黃酮含量，結果以每克樣品中含有相當槲皮素毫克數表示，即mg QE/g。

1.2.4 抗氧化活性測定

(1) 還原能力：參考文獻[18]。以VC為參照，繪制吸光值Y-質量濃度C的標準曲線，得Y= 5.441C+0.200(R2=0.991)，根據標準曲線，計算祁白術甲醇粗提物及各萃取相的還原能力，計算結果以mg VC/g表示。

(2) ABTS自由基清除能力：參考文獻[19]。以VC為標準品，得到吸光值(Y)與VC質量濃度(C)的標準曲線Y=798.8C+11.74(R2=0.997)，根據標準曲線，計算樣品對ABTS自由基的清除效果，計算結果以mg VC/g表示。

(3) DPPH自由基清除能力：參考文獻[20～21]。以VC為參照，制作吸光值Y-質量濃度C的標準曲線，得Y=905.7C+6.485(R2=0.990)，根據標準曲線，計算樣品對DPPH自由基的清除效果，計算結果以mg VC/g表示。

1.2.5 抑菌活性測定 將祁白術甲醇粗提物及各萃取相用二甲基亞砜配置成10.0 mg/mL溶液，將正己烷相配置成1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/mL不同濃度的溶液。采用濾紙片擴散法測定[22]祁白術甲醇粗提物及各萃取相對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑菌圈直徑。正已烷相最小抑菌濃度的測定參考文獻[23～24]。以二甲基亞砜為空白對照組(CK)，以對羥基苯甲酸丙酯為陽性對照組(PP)。

1.2.6 祁白術甲醇粗提物化學成分的GC-MS分析 色譜條件：色譜柱為HP-5MS(5% Phenyl Methyl Silox，30 m×0.25 mm×0.25 μm)的石英毛細管柱；無分流進樣，進樣量為0.5 μL；色譜柱初始溫度為40 ℃(保持3 min)，以4 ℃/min升至160 ℃(保持3 min)，以6 ℃/min升至285 ℃(保持10 min)。質譜條件：離子源為EI源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；掃描范圍m/z為35～450 amu全離子掃描。通過與NIST08標準譜庫的質譜圖作對比，確定待測成分。

1.3 統計學分析

運用SPSS 18.0軟件對試驗結果進行分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan’s多重比較法分析數據間的顯著差異，P<0.05表示差異顯著；采用Pearson’s法分析總酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關性。所有試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 總酚、總黃酮含量分析

由表1可知，祁白術不同極性萃取相的提取率差異顯著，其中水相、正丁醇相及正己烷相的提取率較高，分別為62.98%，13.79%，13.43%。祁白術甲醇粗提物及各萃取相均含有總酚和總黃酮等有效成分，其中總酚含量較多(28.77～139.45 mg TA/g)，而總黃酮含量較少(2.06～21.28 mg QE/g)。不同溶劑對總酚含量影響的變化趨勢為乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>甲醇粗提物>正己烷相>水相，各萃取相均有顯著性差異(P<0.05)。乙酸乙酯相的總酚含量最高，為(139.45±0.19) mg TA/g，其次為二氯甲烷相。乙酸乙酯相從甲醇粗提物中分離的總黃酮高達(21.28±2.28) mg QE/g，是含量最少的水相[(2.06±0.27) mg QE/g]的10.33倍。

表1祁白術不同極性萃取相的提取率及總酚、

總黃酮含量?

Table 1 The extraction yields, contents of total phenolics and total flavonoids of different polarity fractions of Qi Baizhu

樣品提取率/%總酚含量/(mgTA·g-1)總黃酮含量/(mgQE·g-1)甲醇粗提物27.5547.48±1.70d4.87±1.54b正己烷相 13.4344.11±2.67e4.39±0.16b二氯甲烷相5.2698.20±0.22b6.57±1.26b乙酸乙酯相2.00139.45±0.19a21.28±2.28a正丁醇相 13.7968.93±0.74c5.52±0.82b水相 62.9828.77±0.39f2.06±0.27b

? 同列不同上標字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

2.2 抗氧化活性分析

由表2可知，祁白術甲醇粗提物及不同極性萃取相的還原能力、對ABTS和DPPH自由基清除能力均呈顯著性差異(P<0.05)。乙酸乙酯相、正丁醇相及二氯甲烷相的還原能力較強，分別為(38.95±1.66)，(14.48±0.58)，(14.03±0.03) mg VC/g。ABTS自由基清除能力排序為乙酸乙酯相>二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>甲醇相>水相，分別為(302.42±7.51)，(249.63±6.37)，(118.66±2.86)，(75.47±1.44)，(72.25±2.45)，(21.10±0.07) mg VC/g。各萃取相對DPPH自由基具有較強的清除能力且差異顯著(P<0.05)，其中乙酸乙酯相清除能力最強 [(51.61±2.59) mg VC/g]，其次為二氯甲烷相。結果表明，祁白術各萃取相的還原能力、對ABTS和DPPH自由基清除能力的變化規(guī)律具有較好的一致性，其中乙酸乙酯相的抗氧化活性最強。

表2 祁白術不同極性萃取相的抗氧化活性?Table 2 Antioxidant activity of different polarity fractions of Qi Baizhu mg VC/g

? 同列不同上標字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

2.3 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

由表3可知，還原能力與ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力均呈顯著相關(P<0.05)，相關系數R分別為0.875，0.874。ABTS自由基清除能力與DPPH自由基清除能力呈極顯著相關(P<0.01)，相關系數R為0.955。表明3種抗氧化活性檢測方法較好地反映了祁白術甲醇粗提物及不同極性萃取相的抗氧化作用。

祁白術的總酚含量與總黃酮含量之間呈顯著相關，相關系數R為0.907。各萃取相的總酚含量與還原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈極顯著相關(P<0.01)，相關系數R分別為0.949，0.982，0.956。總黃酮含量與還原能力、ABTS自由基清除能力及DPPH自由基清除能力均呈顯著相關，相關系數R分別為0.967，0.831，0.879。這些結果表明，總酚、總黃酮是祁白術中的主要抗氧化活性成分。目前很多研究[25-26]表明，許多植物中的總酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間存在良好的相關性，與本試驗結果相似。

2.4 抑菌活性分析

由表4可知，祁白術的甲醇粗提物、正己烷相、二氯甲烷相及陽性對照(PP)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有不同程度的抑制作用；乙酸乙酯相和正丁醇相對大腸桿菌、綠膿桿菌有一定的抑制作用，但對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌無明顯抑制效果；水相則對4種受試菌均無顯著抑制作用。其中正己烷相的抑菌活性最顯著(P<0.05)，在10 mg/mL濃度下，對受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌(10.38±0.85) mm，金黃色葡萄球菌(10.13±0.48) mm，枯草芽孢桿菌(9.63±0.25) mm，綠膿桿菌(10.25±0.50) mm。

本試驗進一步測定了祁白術活性部位正己烷相不同濃度條件下對4種受試菌的抑制作用。由表5得知，空白對照組(CK)無抑菌作用，而正己烷相在不同濃度條件下對4種受試菌均具有不同程度的抑制效果，且隨著濃度的增大，抑制作用逐漸增強。正己烷相對4種受試菌的最小抑菌濃度均為1 mg/mL，但在各個濃度條件下，對大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制活性強于同等濃度條件下對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的，表明正己烷相對革蘭氏陰性細菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性細菌。

2.5 甲醇粗提物化學成分的GC-MS分析

對甲醇粗提物化學成分進行了GC-MS定性分析，得到總離子流圖，結果見圖1。通過與NIST08標準譜庫的質譜圖作對比，鑒定出18種化合物，占總峰面積量的91.24%，包

表3 祁白術的總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析?Table 3 Correlation analysis between total phenolic, flavonoid contents and antioxidant activity of Qi Baizhu

? *代表顯著相關性(P<0.05)；**代表極顯著相關性(P<0.01)。

表4 祁白術不同極性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑?Table 4 Diameter of inhibitory zone of different polarity fractions of Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

? 萃取物濃度為10 mg/mL，PP濃度為1 mg/mL；同列不同上標字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

表5 祁白術正己烷相對4種菌的抑菌圈直徑?Table 5 Diameter of inhibitory zone of hexane fraction from Qi Baizhu against four common bacterial strains mm

? 同列不同字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

括3種酚類(35.02%)、2種醇類(28.63%)、9種烯類(15.42%)、3種酮類(8.99%)、1種酯類(3.18%)化合物。由表6可知，甲醇粗提物的主要化學成分為3,3'-二氨基-4,4'-二羥基聯苯(33.47%)、β-桉葉醇(28.33%)、β-愈創(chuàng)木烯(5.91%)、3,3,5,6,7-五甲基-1-茚滿酮(4.70%)、癸二酸二異辛酯(3.18%)、γ-欖香烯(3.11%)等。

圖1 祁白術甲醇粗提物的GC-MS總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of methanol crude extract of Qi Baizhu表6 祁白術甲醇粗提物的化學成分及其相對含量

Table 6 Chemical constituents and relative contents of methanol crude extract of Qi Baizhu

序號保留時間/min化合物相對含量/%127.7484(-)-異丁香烯0.54228.0546γ-欖香烯3.11328.8951α-石竹烯0.22429.8654β-蓽澄茄烯0.56529.9536α-芹子烯0.68630.61782,4-二叔丁基苯酚0.36731.4013(+)-巴倫西亞橘烯1.95834.2861(+)-香橙烯1.31934.6182β-愈創(chuàng)木烯5.911035.2097β-桉葉醇28.331135.33943,3'-二氨基-4,4'-二羥基聯苯33.471235.5781長葉烯1.141337.2437桉油烯醇0.301437.9286桔利酮1.301542.57243,3,5,6,7-五甲基-1-茚滿酮4.701644.61151',8'-二羥基-3',6'-二甲基-2'-萘乙酮2.991748.30062-(3,7-二甲基-2,6-二辛烯基-4-甲氧基苯酚1.191855.8812癸二酸二異辛酯3.18

3 結論

經過試驗可知，祁白術乙酸乙酯相中的總酚、總黃酮含量最高，且表現出最強的抗氧化活性。相關性分析表明，總酚、總黃酮含量與還原能力和對ABTS、DPPH自由基清除能力均呈顯著正相關，說明總酚、總黃酮是祁白術中的主要抗氧化活性成分。體外抑菌試驗顯示，正己烷相對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的抑制作用最顯著。經GC-MS分析甲醇粗提物中的主要化學成分，共18種化合物，以酚、醇、烯類化合物為主，其中高含量的酚類、醇類、烯類化合物可能是潛在的抑菌活性成分。本研究闡明了道地藥材祁白術的藥效物質基礎，為祁白術資源的綜合開發(fā)與利用提供了理論依據。下一步將對祁白術活性部位的分離純化做進一步的分析，以明確祁白術抗氧化和抑菌作用的主要組分。

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