雙酶水解雞骨泥的工藝優化

丁小燕 - 張 雯 倪 莉 劉志彬 -

(1. 福州大學食品科學技術研究所，福建 福州 350108；2. 福建省食品生物技術創新工程技術研究中心，福建 福州 350108；3. 百威英博投資﹝中國﹞有限公司，湖北 武漢 430050)

中國是禽肉生產的大國，雞骨作為雞肉加工過程中的副產品，其產量逐年上升。雞骨中含有豐富的蛋白質、脂肪、礦物質、軟骨素、酸性黏多糖和維生素A、B1、B2等多種營養素[1]。其中，雞骨的蛋白質含量可達16.3%，與等量雞肉相似，并且氨基酸含量高，比例均衡，生物價高，是優質的蛋白源[2]。因此，雞骨具有很高的市場利用價值。

但由于雞骨無法直接食用，目前雞骨資源開發利用率較低，主要被加工為骨粉作為動物飼料使用，產品附加值低[3]。利用蛋白酶適度水解，可改善其溶解性、乳化性、起泡性及持水性，從而提高其利用效率。目前已有多篇文獻[4-6]報道了雞骨泥的蛋白酶水解研究，但水解效率有待提高。另一方面，酶法水解動物蛋白產物容易產生苦味、腥味等不良風味[7]，需進一步改進雞骨泥的水解工藝。本試驗擬以雞肉加工的副產品雞骨泥為原料，通過雙酶協同作用對原料進行充分水解以提高原料的綜合利用率，并降低產品的腥味和苦味以提高產品品質。旨在為提高雞骨的綜合利用率提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Flavourzyme復合風味酶(酶活力2.7×104U/g)、Protamex復合蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、Alcalase水解蛋白酶(酶活力3.5×105U/g)：丹麥諾維信公司；

AS.1398中性蛋白酶：酶活力6.0×104U/g，無錫星達生物有限公司；

胰蛋白酶(酶活力7.4×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力8.0×104U/g)：北京華美公司；

中性蛋白酶：酶活力2.7×104U/g，浙江大學食品工程系提供；

新鮮雞腿骨：福建圣農集團有限公司；

其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：L-2000型，配置L-2455型二極管陣列檢測器，日本日立公司；

電子天平：TE601-L型，德國賽多利斯公司；

高速冷凍離心機：CF16RXⅡ型，日本日立公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，上海申騰科技有限公司；

pH計：868型，美國Orion Research公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 新鮮雞腿骨經清水清洗后剔除腿骨肉，使用粉碎機將其粉碎至約80目形成雞骨泥，然后90 ℃水浴30 min，經冷卻后將雞骨泥pH調至各蛋白酶的最適pH。添加酶液在最適反應溫度下水解一定時間，然后85 ℃水浴20 min滅酶，最后使用雙層紗布濾去不溶性成分，獲得雞骨泥的酶解液。

1.3.2 酶解液的分析 采用SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》測定蛋白酶的活力；采用甲醛電位滴定法測定樣品的氨態氮，并計算氮回收率[8]；采用Alder-Nissen法計算水解度(DH)和平均肽鏈長度[9]；采用Waters AccQ-Tag衍生法進行氨基酸組分的分析[10]。

1.3.3 雞骨泥水解蛋白酶的篩選 選用Flavourzyme復合風味酶、Protamex復合蛋白酶、Alcalase水解蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶7種蛋白酶，在其各自的最適條件下對雞骨泥進行水解，測定水解液中蛋白質水解度、氮收率、水解液的風味以及水解液澄清情況，從而初步篩選適當雞骨泥水解蛋白酶。在此基礎上，選擇恰當的雙酶組合對雞骨泥進行水解，以雞骨泥水解度(DH)為指標篩選最佳的雙酶組合。

1.3.4 雞骨泥水解工藝的優化 在確定最佳雙酶組合后，以雞骨泥水解度(DH)為指標，對比分步水解(酶分先后加入)和同步水解(酶同時加入)兩種酶添加方式，確定該雙酶組合的最佳復合方式。最后采用四因素四水平正交試驗[11]考察溫度、pH、酶解時間和酶添加量對雞骨泥水解度(DH)的影響，優化雞骨泥的水解工藝。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶的初步篩選

由表1可知，7種蛋白酶對雞骨泥的水解效果不同，采用AS.1398中性蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、Protamex和胰蛋白酶水解雞骨蛋白時，水解度、氮收率較高，但苦味重，水解液較渾濁。采用木瓜蛋白酶和Flavourzyme復合風味酶時，雖然氮收率較低，但水解液苦味弱，且易于澄清處理。為了提高酶解效率，并提升產品風味，將水解效率較高的3種蛋白酶(AS.1398中性蛋白酶、中性蛋白酶和Alcalase)與產品風味較好的2種蛋白酶(木瓜蛋白酶和Flavourzyme復合風味酶)結合，進行雙酶水解雞骨泥。為了簡化試驗，選擇4種組合方式：① 中性蛋白酶+Flavourzyme；② AS.1398中性蛋白酶+Flavourzyme；③ Alcalase+Flavourzyme；④ 中性蛋白酶+木瓜蛋白酶。

表1 各蛋白酶對雞骨泥的水解效果Table 1 The effect of protease types on the hydrolysis of chicken bone paste

2.2 最佳雙酶組合的篩選

反應溫度、pH、底物濃度、加酶量和反應時間是蛋白質酶解的重要工藝參數，參考預備試驗的數據(表2)分別在中性蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶、Alcalase反應1 h的基礎上加入Flavourzyme復合風味酶或木瓜蛋白酶進行水解試驗，以水解度(DH)為指標篩選最佳的雙酶組合，結果見圖1。

由圖1可知，除中性蛋白酶+木瓜蛋白酶組合外，其它組合雞骨泥分別經Alcalase、中性蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶水解1 h后再加入Flavourzyme復合風味酶，水解效果有明顯改善，較單酶水解的顯著提高。其中水解度高低順序排列為：中性蛋白酶+Flavourzyme >AS.1398中性蛋白酶+Flavourzyme>Alcalase+Flavourzyme>中性蛋白酶+木瓜蛋白酶。經測定，中性蛋白酶+Flavourzyme的雙酶組合水解度可達40%，氮回收率約為90%，而且所得酶解液澄清、無苦味和異味，因此選擇該組合進行后續試驗。

2.3 雙酶水解工藝的優化

2.3.1 雙酶復合方式的確定 用中性蛋白酶與Flavourzyme復合風味酶對雞骨蛋白進行復合水解，分步水解時，控制反應體系的溫度為50 ℃，pH為8.5，加入中性蛋白酶，反應1 h后調整反應體系的pH為7.0，再加入Flavourzyme進行水解；同步水解時，控制反應體系的溫度為50 ℃，pH為8.5，將中性蛋白酶與Flavourzyme共同加入反應體系進行水解。對比兩種水解方式的效率，結果見圖2。

表2 蛋白酶的最佳反應條件Table 2 The optimum enzymolysis conditions of each protease

圖1 雙酶組合對雞骨泥的水解效果

Figure 1 The degree of hydrolysis on chicken bone paste with binary protease combination

由圖2可知，分步水解時，中性蛋白酶水解1 h后加入Flavourzyme，水解度明顯增大，與同步水解相比，兩種工藝對于反應體系的影響并不顯著，為了簡化試驗工藝，采用同步水解的工藝進行水解。

圖2 中性蛋白酶與Flavourzyme的添加方式 對雞骨泥的水解效果

Figure 2 The degree of hydrolysis on chicken bone paste with neutral protease and Flavourzyme under different addition methods

2.3.2 酶解條件的優化 在確定雙酶復合方式后，進一步通過正交試驗優化酶解條件。參考中性蛋白酶和Flavourzyme單酶水解時的各因素(包括溫度、pH、時間和加酶量)參數，從而確定復合酶解時每個因素的條件區間，再進行正交試驗。正交試驗因素水平取值見表3，結果見表4。

表3 正交因素水平表?Table 3 Orthogonal factor level

? 加酶量占底物的質量分數。

表4 L16(45)正交設計方案及試驗結果Table 4 The L16 (45) orthogonal design and results

從正交試驗極差結果顯示，各因素的影響次序為C>D>A>B，最適宜的工藝參數為A3B4C4D4或A3B4C4D3，即溫度為50 ℃，pH值為8.5，水解時間2.5 h，中性蛋白酶與Flavourzyme的酶底比分別為0.75%，2.00%或0.75%，1.50%。考慮到實際生產的成本和能源消耗，確定最佳工藝條件為A3B4C4D3，即溫度50 ℃，pH 8.5，中性蛋白酶與Flavourzyme的酶底比為0.75%，1.50%，底物濃度5%，水解時間為2.5 h。通過驗證，酶雞骨泥的水解度達38.96%。該酶解度顯著優于汪蘭等[5]所報道的使用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶水解雞骨泥所獲得的水解度(16.5%)；也優于馬亞萍等[6]所報道的使用復合蛋白酶水解雞骨渣所獲得的水解度(25.88%)。經分析，酶解產物的平均肽鏈長度為2.57，產品多為短肽和游離氨基酸，易于人體消化吸收。

2.4 雞骨泥及其酶解液游離氨基酸成分分析

對比分析水解前后雞骨泥的游離氨基酸組成，結果見圖3。

由圖3可知，酶解液中共檢測到18種游離氨基酸，其中必需氨基酸含量為53%。游離氨基酸總量達3 936.70 mg/L，是酶解前的2倍，尤其是亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)等的含量顯著增加。

3 結論

本試驗對比了7種蛋白酶及其雙酶組合對雞骨泥的水解效果，確定中性蛋白酶與Flavourzyme復合風味酶的組合水解效果最佳。還通過正交試驗優化了酶解工藝，結果發現在酶解溫度50 ℃、pH值8.5、中性蛋白酶和Flavourzyme的加酶量分別為0.75%和1.50%、底物濃度5%、水解時間2.5 h 條件下酶解效率最高，水解度和氮收率分別為37.11%和92.5%，酶解產物澄清無苦味及腥味。經酶解后，雞骨泥的游離氨基酸含量顯著增加，尤其是亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等含量顯著提高。本試驗所開發的雙酶水解雞骨泥工藝對提高雞骨利用效率有一定的應用價值。

圖3 酶解后游離氨基酸組成的變化Figure 3 The changes of free amino acid before and after enzymatic hydrolysis

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