3種藥劑對獼猴桃花粉潰瘍病菌滅菌及果實產量的影響

曹 凡 高貴田,2 -,2 雷玉山 - 杜瑩琳 - 朱 丹

徐雅芬1XU Ya-fen1 張曉萍1ZHANG Xiao-ping1 李朝政1LI Chao-zheng1 張 鑫1ZHANG Xin1

獼猴桃(Actinidiachinensis)是“水果之王”“維C之冠”[1-2]。全球共有30多個國家栽培種植，其中中國獼猴桃栽培面積及產量最大，分別占全世界的53%和38%[3]。中國獼猴桃的主要產區分布在陜西、四川、安徽等地。絕大多數獼猴桃品種為功能性雌雄異株類型，人工授粉對獼猴桃果實大小及商品性、果肉顏色、產量等具有決定作用[4-6]。近年來，獼猴桃產區爆發毀滅性的細菌性潰瘍病，其病原菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)[6-8]。該病原菌致病性強、危害重、發病速度快、寄主范圍廣[9]，一旦感染發病無有效藥物防治，只有挖樹毀園，嚴重威脅獼猴桃產業的發展。在獼猴桃花粉傳播Psa的研究方面，Gallelli等[10]通過分子檢測水平發現意大利的獼猴桃花粉中存在Psa；Stefani等[11]也從花粉中檢測到Psa，并且認為花粉是導致獼猴桃潰瘍病傳播的重要原因；Vanneste等[12]通過檢測認為新西蘭目前大面積流行的PSA-V(強致病力菌株)病原菌是由于進口帶菌花粉引起；Pattemore等[13]研究發現蜜蜂在Psa的傳播過程中也起了較重要的作用。新西蘭學者Everett等[14]通過熱處理方式殺滅花粉中的Psa，該方法在菌懸液濃度為107CFU/mL，55 ℃ 處理3.1 min，對Psa的殺滅率可達90%，但花粉生活力下降可達50%，對花粉生活力影響較大。目前中國在殺滅花粉中Psa方面還未有報道。

目前，對Psa的田間防治多采用化學試劑對樹干、枝條、土壤等部位進行預防，噻霉酮、可殺得等農藥對Psa的殺滅也取得較好的效果[15-17]。二氧化氯(ClO2)被世界衛生組織和世界糧食組織列為A1級安全高效的消毒劑，殺菌速度快、副產物少、效率高，非常適合作果蔬表面的殺菌消毒劑[18-21]。ClO2具有較強的穩定性和氧化能力，對病毒、真菌、芽孢等具有殺滅作用[22-24]，對獼猴桃表面微生物灰霉[25]、青霉[26]、鏈格孢[27]等多種微生物具有較強的殺菌作用。

本研究選用ClO2、噻霉酮、可殺得三千3種藥劑來殺滅獼猴桃花粉中的Psa，并研究3種藥劑對獼猴桃花粉生活力及獼猴桃果實產量、商品性的影響。建立既能殺死花粉中Psa又能保持花粉活力的消毒方法，為防止獼猴桃花粉傳播Psa提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)：西北農林科技大學植保學院黃麗麗教授惠贈；

獼猴桃花粉：陜西佰瑞獼猴桃研究院有限公司；

ClO2緩釋劑：有效緩釋劑8%，天津市張大科技發展有限公司；

噻霉酮：陜西西大華特科技實業有限公司；

可殺得三千：上海杜邦農化有限公司；

蛋白胨：分析純，北京澳博星生物技術有限責任公司；

硫代硫酸鈉、NaOH、2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-30KBS型，上海申安醫療器械廠；

恒溫振蕩器：THZ-C型，太倉市實驗器械設備廠；

生物顯微鏡：麥克奧迪BA200型，杭州量子檢測儀器有限公司。

1.2 Psa的培養

將Psa甘油菌接種在固體培養基上，于恒溫培養箱24 ℃ 培養3 d，挑取單菌落接種在已滅菌的液體培養基中，于恒溫振蕩器中過夜培養12 h，菌懸液濃度為104CFU/mL。

1.3 3種藥劑對獼猴桃花粉中Psa殺滅效果研究

將培養好的菌懸液均勻噴濕在獼猴桃花粉上，自然晾干。準確稱取被Psa污染的花粉0.1 g于100 mL King’s B 液體培養基中(2.00 g蛋白胨、0.15 g MgSO4·7H2O、0.15 g K2HPO4、1 mL甘油)，24 ℃、200 r/min過夜培養8～12 h，使菌懸液濃度為104CFU/mL。配置ClO2溶液濃度梯度為1.25，12.50，25.00 mg/L；噻霉酮溶液濃度梯度為125.0，312.5，625.0 μL/L；可殺得三千溶液濃度為12.50，31.25，62.50 mg/L。分別吸取菌懸液1 mL對應加入4 mL不同濃度的ClO2、噻霉酮、可殺得三千溶液于10 mL離心管，充分混勻，使ClO2溶液最終濃度分別達到1，10，20 mg/L；噻霉酮溶液最終濃度分別達到100，250，500 μL/L；可殺得三千溶液最終濃度分別達到10，25，50 mg/L。作用時間梯度為15，30，45，60 min 后，加入0.5 mL中和劑(5 g硫代硫酸鈉晶體與20 mL 吐溫80加熱溶于1 000 mL磷酸緩沖液中)，中和10 min，用無菌水代替ClO2溶液進行空白對照。吸取最終樣液100 μL進行涂布，于24 ℃培養箱培養3 d，菌落計數法按式(1)計算：

(1)

式中：

c——殺滅率，%；

m1——對照組菌落數；

m2——試驗組菌落數。

1.4 3種藥劑對花粉生活力影響

準確稱取0.1 g花粉，分別加入1 mL的ClO2溶液濃度為1，10，20 mg/L；噻霉酮溶液濃度為100，250，500 μL/L；可殺得三千溶液濃度為1，5，10 mg/L于10 mL離心管中，充分混勻，分別作用15，30，45 min后，加入0.5 mL中和劑，中和10 min，用無菌水代替ClO2溶液進行空白對照。以氯化三苯基四氯唑(TTC)染色法進行花粉活力的檢測[28]，取1滴最終樣液于載玻片上，加1滴TTC染色劑染色后制成切片，在35 ℃烘箱中放置15 min，于光學顯微鏡下觀察，顯示紅色即為有生活力的花粉。每個處理觀察3個載玻片，每個載玻片觀察3個視野，按式(2)計算：

(2)

式中：

c——花粉生活力，%；

m1——有生活力花粉數；

m2——總花粉數。

1.5 花粉消毒

花粉消毒處理液體授粉花粉溶液根據文獻[29]修改如下：對照組0.5 g 花粉、0.1 g 硼砂、0.3 g 蔗糖、50 μL 柔水通、0.5 g 硫代硫酸鈉、2.0 mL 吐溫80、100 mL磷酸緩沖液。處理組根據對Psa的殺滅率及花粉生活力的試驗結果，將ClO2、噻霉酮、可殺得三千分別加入花粉溶液(0.5 g 花粉、0.1 g 硼砂、0.3 g 蔗糖、50 μL 柔水通、100 mL磷酸緩沖液)中，使終濃度分別為10，500，10 mg/L，處理45，30，15 min后加入中和劑(0.5 g 硫代硫酸鈉、2.0 mL吐溫80)。花粉溶液需現配現用，超過2 h花粉逐漸失去活力，影響授粉效果。

1.6 授粉

以陜西省周至縣九峰鄉5年生獼猴桃種植園為試驗田，選取健康、無病害、樹勢相近的“海沃德”獼猴桃果樹16棵，4棵樹為一試驗組，根據對Psa的殺滅率及花粉生活力的試驗結果，分別設置為ClO2處理組：ClO2溶液濃度10 mg/L，處理時間45 min；噻霉酮處理組：噻霉酮溶液濃度500 μL/L，處理時間30 min；可殺得三千處理組：可殺得三千溶液10 mg/L，處理時間15 min；對照組：不做任何處理。授粉前，將所有雌花在大蕾期進行套袋，防止蜜蜂授粉，盛花期解開套袋并進行授粉，授粉后立即再套袋，防止蜜蜂進行二次授粉。待獼猴桃花瓣自然脫落，解開套袋。進行人工授粉時，以清晨授粉為宜，以確保能夠有充分的授粉率。

1.7 果實座果率、產量、種子數的統計

授粉結束1個月后，調查各樹座果率。10月中旬采摘果實，調查獼猴桃產量、單果重、果實種子數。以每4棵樹為一個試驗組，根據每棵樹的總產量和果實個數計算每棵樹果實單果重。每棵樹分別選取大、中、小3個大小不同的獼猴桃，于室溫下放至變軟，取1/4，去皮、芯，置于紗布中揉搓，將果渣倒入水中搖勻靜置5 min，棄渣取出種子。按式(3)計算座果率。

(3)

式中：

c——座果率，%；

m1——座果數；

m2——授粉花朵數。

2 結果與分析

2.1 3種藥劑對花粉中Psa的殺滅率

由表1可知，隨著處理濃度的升高和時間的延長對Psa殺滅作用逐漸增大。當ClO2的濃度為10 mg/L，處理45 min 時，對Psa的殺滅率達到99%以上，ClO2的濃度為20 mg/L，處理45 min時，對Psa的殺滅率達到100%；噻霉酮的濃度為500 μL/L，處理30 min，對Psa的殺滅率達到99%以上，當處理時間為45 min時，殺滅率可達100%；可殺得三千的處理濃度為10 mg/L，時間為15 min時，殺滅率為99%以上，當處理時間為45 min時，殺滅率可高達100%。

2.2 3種藥劑對花粉生活力的影響

花粉生活力是判斷花粉是否具有授精能力的指標，環境溫度、濕度對花粉生活力都有較大的影響[30]。由表2可知，用噻霉酮和可殺得三千處理花粉后，花粉的生活力隨著藥劑濃度的增大和作用時間的延長而降低；使用ClO2溶液處理花粉后，同一濃度，處理前30 min，花粉生活力逐漸下降，但處理后期，花粉生活力呈上升趨勢。ClO2屬于弱酸類化合物，與孢粉素不溶，花粉的外壁完整，對花粉生活力影響較小。可殺得三千是無機銅制劑，有效成分是氫氧化銅，屬于堿制劑，能溶解孢粉素，破壞花粉外壁，降低花粉生活力。

通過3種藥劑對Psa的殺滅作用和花粉生活力的研究，選擇殺滅作用高且對花粉生活力影響小的藥劑濃度和作用時間。因此本研究選擇ClO2溶液濃度10 mg/L，時間45 min，噻霉酮溶液濃度500 μL/L，時間30 min；可殺得三千溶液濃度10 mg/L，時間15 min。

2.3 3種藥劑處理對獼猴桃產量、種子數的影響

2.3.1 3種藥劑處理對獼猴桃座果率的影響 獼猴桃花粉的生活力直接影響果實的座果率，花粉生活力越大，座果率越高。授粉前，對照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組花朵數分別為63.47，71.45，78.47，81.85個，授粉1個月后統計座果數分別為53.00，52.50，52.75，57.75個，座果率分別為83.5%，73.48%，67.22%，70.56%，較對照組分別下降12.0%，15.5%，19.5%，各處理組均與對照組有極顯著性差異(P<0.01)，但ClO2處理組對座果率影響較小，見圖1。因此，在生產中，應盡量選擇對座果率影響較小的試劑處理花粉。

表1 3種藥劑作用濃度和時間對花粉中Psa殺滅效果的影響?Table 1 Efficacy of three kinds of medicament in killing Psa of pollen for different periods of concentration and time (n=3)

? 試驗溫度是25 ℃；不同小寫字母表示縱向P≤5%差異顯著性，不同大寫字母表示橫向P≤5%差異顯著性。

表2 3種藥劑作用濃度和時間對花粉生活力的影響?Table 2 Efficacy of three kinds of medicament in killing Psa for different periods of concentration and time (n=3)

? 不同小寫字母表示縱向P≤5%差異顯著性，不同大寫字母表示橫向P≤5%差異顯著性。

2.3.2 3種藥劑處理對獼猴桃總產量的影響 由圖2可知，對照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實的總產量分別為4 455.0，4 205.0，4 078.5，3 955.0 g，3種藥劑處理花粉后總產量都有下降，以可殺得三千處理組下降最多，較對照組下降11.2%，差異顯著(P<0.05)；ClO2處理組和噻霉酮處理組較對照組分別下降5.6%和8.4%，均無顯著性差異，以ClO2處理組較好。

2.3.3 3種藥劑處理對獼猴桃單果重的影響 由圖3可知，對照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實的單果重分別為84.06，79.02，75.65，68.48 g，3種藥劑處理花粉后果實的單果重都有降低，以可殺得三千處理組下降最多，較對照組下降18.5%，差異顯著(P<0.05)；ClO2處理組和噻霉酮處理分別下降6%和10%，均無顯著性差異，說明ClO2處理組和噻霉酮處理組對獼猴桃單果重的影響不大，以ClO2處理組較好。

圖1 3種藥劑處理對獼猴桃座果率的影響Figure 1 Effects of three kinds of medicament on setting rate of kiwifruit (n=3)

圖2 3種藥劑處理對獼猴桃總產量的影響Figure 2 Effects of three kinds of medicament on output of kiwifruit (n=3)

2.3.4 3種藥劑處理對獼猴桃種子數的影響 授粉效果影響果實種子數量，從而影響果實大小。一般種子越多，果實越大，風味越好[31-32]。由圖4可知，對照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實種子數分別為791.75，781.50，479.00，480.25個，其中可殺得三千處理組和噻霉酮處理組的果實種子數較對照組下降可達35%以上，差異極顯著(P<0.01)；ClO2處理組的種子數僅下降1.2%，無顯著性差異，表明ClO2處理組對種子數影響較小。結果與郭曉成[33]發現的獼猴桃果實中種子數量與果實大小呈正相關結果一致，同時也說明在液體授粉前將ClO2加入花粉溶液進行花粉中Psa消毒在獼猴桃栽培生產中有比較廣闊的應用前景。

圖3 3種藥劑處理對獼猴桃單果重的影響Figure 3 Effects of three kinds of medicament on weight of single kiwifruit (n=3)

圖4 3種藥劑處理對獼猴桃種子數的影響Figure 4 Effects of three kinds of medicament on on seed number of kiwifruit (n=3)

3 結論

被Psa污染的花粉以10 mg/L ClO2溶液處理45 min對花粉中Psa的殺菌率為99.7%，而花粉生活力僅下降0.5%、座果率下降12%、總產量下降5.6%、單果重下降6%、種子數下降1.2%，表明10 mg/L ClO2溶液處理45 min對花粉中Psa殺菌率高，花粉生活力影響小，在生產上能有效防止獼猴桃花粉傳播Psa，具有較大的推廣價值。前人的研究方法對花粉的生活力影響較大，本研究方法對花粉的生活力影響較小，但在授粉時需要將花粉配制成液體，加大了授粉難度，生產上一般選用干粉授粉，因此后續的試驗可深入研究干粉授粉，降低授粉難度。

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