牡荊素保護DNA氧化損傷的活性評價及機制分析

陳 班 李達歡 - 李熙燦 -

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

由活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)引起的DNA氧化損傷，可以導致細胞的氧化應激，引起基因突變、癌變以及神經退行性病變[1]。羥自由基 (·OH)為ROS中最具殺傷力的自由基，既可以進攻DNA中的鳥嘌呤堿基，生成8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)，也可以進攻脫氧核糖骨架，生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)等產物。8-OHdG與MDA，均是細胞氧化應激的毒性產物[2]。所以， 8-OHdG 已作為重要生物標識物，用于DNA氧化損傷相關疾病的篩查[3]。而臍帶血中的MDA含量的檢測，可用于判斷早產兒的氧化應激狀況與DNA損傷的水平[4]。因此，尋找合適的抗氧化劑，保護DNA免受氧化損傷，減少相關毒性產物的生成，已成為自由基生物醫學研究的一項重要內容。

前期的研究[5]表明，食用植物中的抗氧化成分主要為多酚類化合物。可食用的多酚主要有黃酮及黃酮苷、類黃酮、雙黃酮等，其中以黃酮及黃酮苷最常見。牡荊素(vitexin, apigenin-8-C-glucoside)是一種典型的黃酮類化合物(圖1)，存在于山楂等可食用植物中。據文獻[6]報道，山楂葉的牡荊素含量為0.04～0.06 mg/g。含有牡荊素的山楂葉總黃酮有抗心肌缺血及再灌注損傷、降低血脂等藥理活性，這些藥理活性與總黃酮的抗氧化性均有直接關聯[7]。

此前，一些零星報道[8-10]提及牡荊素的抗氧化作用，不過，尚未涉及牡荊素對DNA氧化損傷的修復(或保護)活性。本試驗擬采用DNA保護能力分析法，研究牡荊素的DNA保護能力；運用Ferrozine法和紫外可見光譜(UV-Vis)法，分析其Fe2+絡合反應；運用Cu2+還原法，測定其電子轉移ET(Electron-transfer)能力。在此基礎上，進一步闡釋牡荊素保護DNA氧化損傷可能的化學機制，為牡荊素應用于DNA氧化損傷相關疾病的防治提供依據。

圖1 牡荊素結構式Figure 1 The structure of vitexin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牡荊素(CAS：3681-93-4)：HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

Trolox(水溶性維生素E)、BHA(丁基羥基茴香醚)、Ferrozine(菲洛嗪)、Neocuproine(新銅試劑)：分析純，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

ABTS(2’-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、魚精DNA鈉鹽：分析純，美國Amresco公司；

KH2PO4、Na2HPO4、Na2EDTA、FeCl3、CuSO4、H2O2、DMSO(二甲基亞砜)、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、抗壞血酸、檸檬酸鈉、乙酸銨、甲醇、乙醇：分析純，廣州化學試劑廠。

1.1.2 主要儀器設備

可見分光光度計：2100型，上海尤尼科儀器有限公司；

電子天平：BS110S型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

超聲波清洗機：SB3200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

便攜式pH計：YSI pH100型，上海維賽儀器貿易有限公司；

恒溫水浴鍋：DZKW型，北京市永光明醫療儀器廠；

電熱恒溫鼓風干燥器：DHG-9070A型，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA保護能力分析法 參考文獻[11]修改如下，取適量(0，100，150，200，250，300 μL)牡荊素溶液(2 mg/mL，DMSO溶解)至離心管中，揮干溶劑，往其中加入300 μL的KH2PO4/Na2HPO4緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)和100 μL Na2EDTA溶液(0.25 mmol/L)。隨后，依次加入50 μL FeCl3溶液(1.6 mmol/L)，75 μL的H2O2溶液(16.8 mmol/L)和50 μL底物DNA溶液(5 mg/mL魚精DNA鈉鹽)。再加入75 μL抗壞血酸溶液(33.6 mmol/L)，補加緩沖溶液，使反應液總體積達到1 050 μL，搖勻，將該離心管置于50 ℃水浴中20 min，取出，再加入250 μL三氯乙酸溶液(100 mg/mL)和150 μL 2-硫代巴比妥酸溶液(50 mg/mL)，于105 ℃烘箱中加熱15 min，在532 nm處測定其吸光度值A。試驗以Trolox和BHA為陽性對照。按式(1)計算牡荊素對DNA的保護率R。

(1)

式中：

R——DNA保護百分率，%；

A0——未加樣品的溶液吸光度；

A——加入樣品后溶液的吸光度。

1.2.2 Ferrozine法 參考文獻[11]修改如下：取FeCl2溶液(250 μmol/L) 0.1 mL，加適量(0，400，600，1 200，1 600，2 000 μL)牡荊素(0.01 mg/mL，DMSO 溶解)溶液，充分混合后靜置3 min，再加入0.8 mL甲醇，0.15 mL Ferrozine (500 μmol/L)溶液，靜置5 min后，在562 nm下測定吸光度值A。按式(2)計算牡荊素對Fe2+絡合率C。

(2)

式中：

C——Fe2+絡合百分率，%；

A0——未加樣品的溶液吸光度；

A——加入樣品后溶液的吸光度。

1.2.3 Fe2+絡合產物UV-Vis光譜分析 參考文獻[12]修改如下：取樣品溶液(1 mg/mL，DMSO溶解)100 μL，加入100 mg/mL FeCl2溶液300 μL，再加入甲醇水(1∶1)600 μL。在反應0，5，10，20，30，40，50，60，120 min時進行UV-Vis光譜掃描。最后對反應液、樣品液和FeCl2溶液進行顏色對比。

1.2.4 Cu2+還原法 參考文獻[11]修改如下：取10 mmol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新銅試劑各125 μL混勻，依次加入牡荊素溶液(0.5 mg/mL，DMSO溶解)xμL(x=150，200，250，300，350)，0.1 mol/L乙酸銨緩沖液(700-x) μL，混合后靜置30 min，在450 nm下測吸光度值A。按式(3)計算牡荊素對Cu2+相對還原率S。

(3)

式中：

S——Cu2+的相對還原百分率，%；

A0——未加樣品液時所測吸光度；

Amax——一次測量內最大的吸光度；

A——加入樣品液時所測吸光度。

2 結果與分析

2.1 DNA保護能力及機制

由于·OH進攻DNA的脫氧核糖部分會生成MDA等毒性物質，從而導致多種疾病的發生[13-15]。因此，抑制MDA的生成，可有效保護DNA免受氧化損傷。通過檢測MDA與2-硫代巴比妥酸形成的硫代巴比妥酸反應產物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)復合物的含量，可以檢測MDA的存在。TBARS在532 nm處有最大吸收。如果A532 nm值降低，則表明MDA的生成得到了有效抑制，DNA在一定程度上受到保護。因此，該模型可用來評估DNA氧化損傷的程度。如圖2(a)所示，在0～0.6 mg/mL的濃度范圍內，牡荊素的DNA保護能力與其濃度呈現出良好的量效關系。從表1可以看出，其DNA保護能力約為Trolox的2.50倍。這表明，牡荊素能保護DNA免受·OH誘導的氧化損傷。

表1 各個檢測指標下樣品和陽性對照的IC50值?Table 1 The IC50 values of vitexin and the positive controls

?IC50指被測量的拮抗劑的半抑制濃度；同行不同上標字母表示數據有顯著差異(P<0.05)；比值指相應指標下水溶性維生素E或檸檬酸鈉的IC50與牡荊素的IC50之比；N.D.指不需測。

圖2 牡荊素抗氧化作用的量效關系圖Figure 2 The dose response curves of vitexin in various antioxidant assays

2.2 Fe2+絡合活性及機制

據文獻[16]報道，在H2O2對酒石酸的氧化過程中，Fe2+可以極大提高反應速率，后通過順磁共振試驗(ESR)證實，在此反應體系中，·OH是實際的氧化中間體。在沒有金屬離子存在時，DNA能對抗濃度約10 mmol/L的H2O2[17]，但只要有皮克級的Fe2+參與反應，就能夠使H2O2轉化成·OH，從而引起DNA 的氧化損傷[18]。在細胞中，這種催化作用通過Fenton反應(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+·OH-)實現[12,19-22]。因此，絡合Fe2+可以有效地減少·OH 的生成，從而保護DNA免受·OH誘導的氧化損傷，使細胞能健康成長甚至分化[23]。

從圖2(b)中可以看出，在0～7 μg/mL的濃度范圍內，牡荊素對Fe2+的絡合能力與其濃度呈現劑量相關性。據表1可知，牡荊素、檸檬酸鈉的鐵絡合能力的IC50值分別為(9.3±1.2)，(9.6±2.8) μmol/L，二者沒有顯著的統計學差異，表明兩者的鐵絡合能力相似。從圖3(a)可知，絡合產物在200～400 nm 的波長范圍內，其紫外吸收強度有一定程度的增加。從圖3(b)可以看出，牡荊素在與Fe2+混合的60 min 與120 min 的吸收強度很接近(線條⑧和⑨)，說明該反應在60 min時已基本達到平衡。而在二者混合的瞬間(0 min)，即在554 nm處生成新的吸收峰(線條①)，其強度已超過120 min時(線條⑨)吸收強度的50%，說明牡荊素的Fe2+絡合反應是一個快速反應。此時，牡荊素樣品溶液由淡黃色變成了黃綠色，其554 nm處摩爾吸光系數ε=2 680.74 L/(mol·cm)。總之，牡荊素對Fe2+有一定的絡合作用，該絡合作用可能是牡荊素保護DNA免受氧化損傷的機制之一。

牡荊素絡合Fe2+的能力，與其分子結構的特點有關。牡荊素分子的4-羰基和5-羥基為共平面構型，Fe2+易在此處構成一個平面的環狀結構。因此，牡荊素可能在4-羰基-5-羥基之間存在一個Fe2+絡合位點，其絡合反應式見圖4。由圖4 可知，Fe2+在4-羰基-5-羥基之間形成了一個六元環，由于六元環的角張力最小，所以，其Fe2+絡合的片段結構是穩定的，與此前的一些報道[18,19,22,24]相吻合。綜上，牡荊素的Fe2+絡合能力得益于其環狀的結構。對于一些鏈狀的脂肪酸(如十六酸)而言，則不可能與Fe2+絡合[25-26]；而對于一些環狀的倍半萜內酯(如白術內酯[27])而言，由于沒有環外的羰基或羥基，同樣不能表現出Fe2+絡合活性。這反過來印證了：牡荊素絡合Fe2+的能力，與分子的環狀結構(特別是平面構型的4-羰基-5-羥基)相關。

①～⑨ 分別為0.1 mg/mL牡荊素與30 mg/mL Fe2+絡合0，5，10，20，30，40，50，60，120 min后的掃描結果; ⑩ 為0.1 mg/mL牡荊素溶液掃描結果；為30 mg/mL FeCl2溶液掃描結果

圖3 牡荊素與Fe2+絡合產物的UV光譜圖及Vis光譜圖

Figure 3 The UV-spectra and Vis-spectra of vitexin

binding to Fe2+complexing

圖4 牡荊素絡合Fe2+的可能反應Figure 4 The possible reaction of vitexin complexing with Fe2+

2.3 Cu2+還原活性及機制

由圖2(c)可知，在0.00～0.16 mg/mL的濃度范圍內，牡荊素對Cu2+的還原能力與其濃度呈現出良好的劑量相關性。這表明牡荊素具有一定的Cu2+還原能力。而Cu2+還原本質是一個電子轉移的過程[16-18]，因此，在牡荊素保護DNA免受·OH誘導的氧化損傷的過程中，可能涉及到電子轉移。

3 結論

牡荊素具有良好的保護DNA免受·OH誘導的氧化損傷的能力。其保護機制可能與電子轉移及Fe2+絡合有關。其Fe2+絡合反應的位點，可能在4-羰基-5-羥基之間。這些抗氧化化學機制的闡釋，將推動牡荊素在DNA氧化損傷相關的疾病方面發揮作用。

[1] CADET J, WAGNER J R. DNA base damage by reactive oxygen species, oxidizing agents, and UV radiation[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2013, 5(2): a12 559.

[2] KULMS D, ZEISE E, P?PPELMANN B, et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5 844.

[3] KARKI K, PANDE D, NEGI R, et al. An Assessment of oxidative damage and non-enzymatic antioxidants status alteration in relation to disease progression in breast diseases[J]. Med Sci (Basel), 2016, 4(4): 17.

[4] NORISHADKAM M, ANDISHMAND S, ZAVAR REZA J, et al. Oxidative stress and DNA damage in the cord blood of preterm infants[J]. Mutat Res, 2017, 824: 20-24.

[5] LI Xi-can, CHEN Dong-feng, MAI Ying, et al. Concordance between antioxidant activities in vitro and chemical components of Radix Astragali (Huangqi)[J]. Natural Product Research, 2012, 26(11): 1 050-1 053.

[6] 王鑫波, 高敏, 童麗姣, 等. 山楂葉提取物中牡荊素鼠李糖苷的含量測定[J]. 中華中醫藥學刊, 2010, 28(10): 2 098-2 100.

[7] JURIKOVA T, SOCHOR J, ROP O, et al. Polyphenolic profile and biological activity of Chinese hawthorn (Crataegus pinnatifida BUNGE) fruits[J]. Molecules, 2012, 17(12): 14 490-14 509.

[8] KANG Jie, LI Zhi-min, WU Tong, et al. Anti-oxidant capacities of flavonoid compounds isolated from acai pulp (Euterpe oleracea Mart)[J]. Food Chemistry, 2010, 122(3): 610-617.

[9] ZHANG Xue, XU Dao-hua. Research progress of pharmacolog-ical action of vitexin[J]. China Medical Herald, 2013, 35: 41-44.

[10] NI Qin-xue, LIU Ying-kun, GONG Ling-xiao, et al. Active components in six kinds of ground bamboo leaves and their anti-oxidant activities[J]. Chinese Traditional & Herbal Drugs, 2011, 42(11): 2 317-2 321.

[11] LI Xi-can, MAI Wen-qiong, LI Wang, et al. A hydroxyl-scavenging assay based on DNA damageinvitro[J]. Analytical Biochemistry, 2013, 438(1): 29-31.

[12] JIANG Qian, LI Xi-can, TIAN Ya-ge, et al. Lyophilized aqueous extracts of Mori Fructus and Mori Ramulus protect mesenchymal stem cells from ·OH-treated damage: bioassay and antioxidant mechanism[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine, 2017, 17(1): 242-252.

[13] LI Xi-can, HU Qiu-ping, JIANG Shu-xia, et al. Flos Chrysanthemi Indici protects against hydroxyl-induced damages to DNA and MSCs via antioxidant mechanism[J]. Journal of Saudi Chemical Society, 2015, 19(4): 454-460.

[14] KIWI J, LOPEZ A, NADTOCHENKO V. Mechanism and kinetics of the ·OH-radical intervention during Fenton oxidation in the presence of a significant amount of radical Scavenger (Cl-)[J]. Environmental Science & Technology, 2000, 34(11): 2 162-2 168.

[15] PERRON N R, BRUMAGHIM J L. A review of the antioxid-ant mechanisms of polyphenol compounds related to iron binding[J]. Cell Biochemistry & Biophysics, 2009, 53(2): 75-100.

[16] LIN Jing, LI Xi-can, LI Chen, et al. Protective effect against hydroxyl radical-induced DNA damage and antioxidant mechanism of [6]-gingerol: A Chemical Study[J]. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2014, 35(6): 1 633-1 638.

[17] LI Xi-can, LIU Jing-jing, LIN Jing, et al. Protective effects of dihydromyricetin against ·OH-induced mesenchymal stem cells damage and mechanistic chemistry[J]. Molecules, 2016, 21(5): 604-616.

[18] LI Xi-can, MAI Wen-qiong, CHEN Dong-feng. Chemical study on protective effect against hydroxyl-induced DNA damage and antioxidant mechanism of myricitrin[J]. Journal of the Chinese Chemical Society, 2014, 61: 383-391.

[19] LI Xi-can, JIANG Qian, WANG Ting-ting, et al. Comparison of the antioxidant effects of quercitrin and isoquercitrin: understanding the role of the 6″-OH group [J]. Molecules, 2016, 21(9): 1 246-1 256.

[20] MARINOV N M. A detailed chemical kinetic model for high temperature ethanol oxidation[J]. International Journal of Chemical Kinetics, 2015, 31(3): 183-220.

[21] XIE Yu-lu, LI Xi-can, XU Jie-ying, et al. Two phenolic antioxidants in Suoyang, enhance viability of ·OH-damaged mesenchymal stem cells: comparison and mechanistic chemistry [J]. Chemistry Central Journal, 2017, 11(1): 84-94.

[22] WANG Ting-ting, ZENG He-ping, LI Xi-can, et al. In vitro studies on the antioxidant and protective effect of 2-substituted-8-hydroxyquinoline derivatives against H2O2-Induced oxidative stress in BMSCs[J]. Chemical Biological Drug Design, 2010, 75(2): 214-222.

[23] LI Xi-can, LU Han, LI Yun-rong, et al. Protective effect of sinapine against hydroxyl radical-induced damage to mesenchymal stem cells and possible mechanisms[J]. Chem. Pharm. Bull. 64, 319-325,

[24] WANG Guang-rong, LI Xi-can, ZENG He-ping. Synthesis, antioxidation activity of (E)-9-p-Tolyl-3-[2-(8-hydroxy-quinol-2-yl)vinyl]-carbazole and (E)-9-(p-Anisyl)-3-[2-(8-hydroxy-quinol-2-yl)vinyl]-carbazole and their induction proliferation of mesenchymal stem cells[J]. Act Chimica Sinica, 2009, 67(9): 974-982.

[25] CHEN Dong-feng, LI Xi-can, XU Zhi-wei, et al. Hexadecanoic acid from Buzhong Yiqi decoction induced proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13(4): 967-970.

[26] LI Xi-can, HAN Wei-juan, MAI Wen-qiong, et al. Antioxidant activity and mechanism of tetrahydroamentoflavone in vitro[J]. Natural Product Communications, 2013, 8(6): 787-789.

[27] LI Xi-can, WEI Gang, WANG Xiao-zhen, et al. Targeting of the Shh pathway by atractylenolides promotes chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2012, 35(8): 1 328-1 335.