紅皮火龍果皮多糖過氧化氫脫色工藝及抑菌活性研究

方曉暉 - 但德苗 - 錢時權(quán) - 陸兆新 -

(1. 蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

紅皮火龍果(Dragon fruit)，又稱紅龍果、龍珠果等，屬仙人掌科植物，果實營養(yǎng)豐富，富含多種活性物質(zhì)，如甜菜苷、色素、植物多糖和酚醛樹脂等[1]，其中，植物多糖具有抑菌[2]、抗氧化[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和預(yù)防癌癥[5]等生物活性。目前，有關(guān)紅皮火龍果的研究主要集中在果皮色素和果膠的提取等方面[6]。

紅皮火龍果皮含有大量色素，不利于植物多糖的分離和提取。目前，主要利用活性炭粉末、大孔樹脂和過氧化氫等對多糖進行脫色[7]。采用活性炭脫色得到的多糖保留率較低，而采用過氧化氫進行脫色可有效使有色物質(zhì)分解且不易復(fù)色，其多糖保留率也較高，成本低廉，試驗過程簡單[8-10]。由于紅皮火龍果皮多糖含有較多色素，如何對得到的多糖進行有效脫色也有一定困難。目前國內(nèi)外還沒有利用過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色的報道。本研究以紅皮火龍果果皮為研究對象，采用過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色，優(yōu)化多糖脫色的工藝條件，并研究紅皮火龍果皮多糖對細菌的抑菌活性，旨在為紅皮火龍果副產(chǎn)物的有效利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮火龍果：購自蚌埠當(dāng)?shù)爻校?/p>

30%過氧化氫、95%乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌屬(Escherichiacoli)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌屬(Staphylococcusaureus)：蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實驗室保存；

LB固體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；

高速離心機：TGl16-C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9272型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

紫外可見分光光度計：752型，上海光學(xué)儀器廠；

電子分析天平：FA1204C型，上海精密儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅皮火龍果皮多糖的制備 將新鮮紅皮火龍果洗凈，手工剝?nèi)☆伾迈r、無明顯疤痕的果皮于60 ℃干燥箱中干燥至恒重，粉碎過60目篩，得紅皮火龍果皮干燥粉末。精確稱取3.00 g紅皮火龍果果皮粉末(含粗脂肪0.16%，蛋白質(zhì)0.75%)置于索氏抽提器中進行脫脂[11]，按照料液比1∶15(g/mL)的比例加入蒸餾水，于90 ℃提取1 h后，6 000 r/min離心10 min，得上清液。向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min離心10 min，保留沉淀，用95%乙醇洗滌沉淀3次，合并沉淀，得到粗多糖。將粗多糖沉淀溶于100 mL蒸餾水，按 4∶1 的體積比加入Sevag 試劑[12]，使溶液充分混勻后，4 000 r/min離心5 min，進行脫蛋白(重復(fù)3次)，向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，得到純化后的多糖(粗脂肪和蛋白質(zhì)徹底除去)。將多糖充分溶解于蒸餾水中得到多糖溶液。加入一定濃度的過氧化氫，置于恒溫水浴鍋中水浴脫色處理，6 000 r/min離心10 min，得上清液。向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，經(jīng)真空干燥后，得到紅皮火龍果皮多糖粉末。多糖得率和多糖保留率分別按式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：

A——多糖得率，%；

m——多糖粉末的質(zhì)量，g；

M——紅皮火龍果皮粉末的質(zhì)量，g；

B——多糖保留率，%；

X0——脫色前多糖得率，%；

X1——脫色后多糖得率，%。

1.2.2 單因素試驗

(1) 過氧化氫濃度對多糖脫色的影響：取0.30 g紅皮火龍果皮多糖干粉溶于50 mL蒸餾水中，加入濃度為2%，3%，4%，5%，6%，7%的過氧化氫溶液，置于60 ℃恒溫水浴鍋中脫色2 h后，在450 nm處測定吸光度，計算脫色率。每組試驗重復(fù)3次。脫色率按式(3)計算：

(3)

式中：

C——脫色率，%；

A1——過氧化氫脫色前450 nm處火龍果皮多糖溶液的吸光度；

A0——過氧化氫脫色后450 nm處火龍果皮多糖溶液的吸光度。

(2) 脫色溫度對多糖脫色的影響：設(shè)置脫色溫度為50，55，60，65，70，75 ℃，固定過氧化氫濃度為4%，脫色時間為2 h，每組試驗重復(fù)3次?？疾烀撋珳囟葘Χ嗵敲撋实挠绊?。

(3) 脫色時間對多糖脫色的影響：設(shè)置脫色時間為60，80，100，120，140，160 min，固定過氧化氫濃度為4%，脫色溫度為60 ℃，每組試驗重復(fù)3次?？疾烀撋珪r間對多糖脫色率的影響。

1.2.3 Box-Behnken設(shè)計 結(jié)合單因素試驗結(jié)果，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對影響火龍果皮多糖脫色的顯著因素過氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時間進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以多糖脫色率為考察指標(biāo)，進行Box-Behnken設(shè)計。

1.2.4 抑菌活性試驗 將脫色后的紅皮火龍果皮純多糖完全溶解于無菌水中，配置成濃度為10，20，40，80 mg/mL多糖溶液，用0.22 μm濾膜過濾，備用。挑取供試菌(大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)單菌落接入新鮮LB斜面培養(yǎng)基后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水制成活細胞濃度為106CFU/mL的菌懸液備用。采用濾紙片擴散法進行抑菌活性測定[13]。取0.2 mL菌懸液均勻涂布于凝固的瓊脂培養(yǎng)基中。將經(jīng)不同濃度的紅皮火龍果皮多糖溶液浸泡過的濾紙片，放置在含菌培養(yǎng)皿上，每個平皿放3片，并以浸泡過無菌生理鹽水的濾紙片作為對照。每一種菌重復(fù)3次，每個濃度作5個平行。于37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

紅皮火龍果皮多糖對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)的測定方法采用2倍稀釋法[14]。在測定4種供試菌抑菌活性所需多糖濃度的基礎(chǔ)上，將純多糖完全溶解于無菌水中，配置成濃度為1.875，3.750，7.500，15.000，30.000，45.000，60.000，120.000 mg/mL 多糖溶液，過0.22 μm濾膜。分別取1.0 mL 不同濃度的多糖溶液和0.2 mL活細胞濃度為106CFU/mL的菌懸液加入到培養(yǎng)皿中，再倒入40 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，凝固后，于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。以不加多糖的瓊脂培養(yǎng)基為對照，觀察平板上菌落生長情況，無菌生長的最低濃度為紅皮火龍果皮多糖的最小抑制濃度。每一種菌重復(fù)3次，每個濃度做5次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫脫色單因素試驗

2.1.1 過氧化氫濃度的影響 由圖1可知，當(dāng)過氧化氫濃度從1%增加到4%時，紅皮火龍果皮多糖的脫色率顯著增加，而過氧化氫濃度由4%提高到6%時，多糖脫色率增加緩慢。由于高濃度的過氧化氫容易分解，因此在進行過氧化氫稀釋時，盡量保持低溫。稀釋后的過氧化氫由于濃度下降而使反應(yīng)速率降低，從而減緩了過氧化氫的分解，利于提高過氧化氫利用效率。綜合考慮，取4%為適宜的過氧化氫濃度。

圖1 過氧化氫濃度對多糖脫色的影響

Figure 1 Effect of the hydrogen peroxide concentration on decolorization of polysaccharide

2.1.2 脫色溫度的影響 由圖2可知，隨著脫色溫度的升高，多糖脫色率逐漸增加；50～60 ℃時，多糖脫色率顯著增加，之后多糖脫色率增加不明顯。考慮到紅皮火龍果皮多糖在高溫條件下活性可能會受損，選擇60 ℃為適宜脫色溫度。

2.1.3 脫色時間的影響 由圖3可以看出，隨著脫色時間的延長，多糖脫色率升高；60～100 min時，多糖脫色率顯著增加，之后繼續(xù)延長脫色時間，多糖脫色率不再增加。考慮到節(jié)能等因素，選擇100 min為適宜的脫色時間。

圖2 脫色溫度對多糖脫色的影響Figure 2 Effect of the decolorization temperature on decolorization of polysaccharide

圖3 脫色時間對多糖脫色的影響Figure 3 Effect of the decolorization time on decolorization of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化過氧化氫脫色工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取過氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時間為自變量，以多糖脫色率為響應(yīng)值，根據(jù)表1進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results ofresponse surface analysis

根據(jù)表2所得試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

Y=-373.13+20.19A+11.32B+125C-0.04AB-0.01AC-2.5BC-1.9A2-0.09B2-4.81C2。

(4)

對表2的數(shù)據(jù)，進行方差分析，得到結(jié)果見表3。由表2、3可知，得到的模型(P<0.000 1)顯著；失擬項不顯著(P=0.879 7>0.05)，表明該模型的擬合度較好；R2= 0.999 3，說明此模型能解釋多糖脫色率99.93%的變異。一次項A、B和C極顯著(P<0.000 1)，表明過氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率影響極顯著。交互項(AB、AC、BC)和二次項(A2、B2、C2)影響均極顯著(P<0.000 1)，由F值大小可知，影響紅皮火龍果皮多糖脫色率主要因素主次順序為 C>B>A，即脫色時間>脫色溫度>過氧化氫濃度。

2.3 響應(yīng)面法分析

根據(jù)回歸方程，得出過氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。由圖4可知，當(dāng)固定脫色時間不變時，紅皮火龍果皮多糖的脫色率隨過氧

表3 方差分析表?Table 3 Variance analysis

化氫濃度和脫色溫度的升高，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。圖5表明，過氧化氫濃度和脫色時間對多糖的脫色率交互作用影響極顯著。當(dāng)固定脫色溫度不變時，多糖脫色率隨過氧化氫濃度的增加和脫色時間的延長，呈先升后趨于平緩的趨勢。由圖6可知，當(dāng)固定過氧化氫濃度不變時，多糖脫色率隨脫色溫度和脫色時間的變化而變化，表現(xiàn)為先隨脫色溫度和脫色時間的增大而增大，當(dāng)多糖脫色率達到一定值后不再增加。

通過對回歸模型和響應(yīng)面進行分析，確定采用過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色的最佳工藝條件為：過氧化氫濃度4.32%，脫色溫度61.72 ℃，脫色時間109.04 min，在該條件下紅皮火龍果皮多糖的脫色率最大預(yù)測值為88.31%。考慮到實際試驗條件，對最佳條件進行了調(diào)整：過氧化氫濃度4.3%，脫色溫度62 ℃，脫色時間109 min，在該條件下進行驗證實驗，得到紅皮火龍果皮多糖的實際脫色率為88.17%，平均誤差為1.97%(n=3)，實驗值與理論值基本吻合。同時，測得紅皮火龍果皮多糖保留率為82.39%，平均誤差為1.52%(n=3)。結(jié)果表明該模型能有效預(yù)測過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色的最佳工藝條件。

2.4 紅皮火龍果皮多糖的抑菌活性

由表4可以看出，紅皮火龍果皮多糖對4種供試菌都有一定的抑制作用，其抑菌活性隨多糖濃度的增加而不斷增強。

圖4 過氧化氫濃度和脫色溫度交互作用對多糖脫色率的影響Figure 4 Interaction effects of the hydrogen peroxide concentration (A) and the decolorization temperature (B) on the decolorization rate of the polysaccharide

圖5 過氧化氫濃度和脫色時間交互作用對多糖脫色率的影響Figure 5 Interaction effects of the hydrogen peroxide concentration (A) and the decolorization time (C) on the decolorization rate of the polysaccharide

圖6 脫色溫度和脫色時間交互作用對多糖脫色率的影響Figure 6 Interaction effects of the decolorization temperature (B) and the decolorization time (C) on the decolorization rate of the polysaccharide表4 紅皮火龍果皮多糖的抑菌結(jié)果?Table 4 Antibacterial activity results of the polysaccharide from red dragon fruit peel

多糖濃度/(mg·mL-1)抑菌圈直徑/mm大腸桿菌蠟樣芽孢桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌8017.4±0.3a16.7±0.3a13.6±0.3a12.8±0.2a4017.2±0.4a16.4±0.3a13.1±0.2a12.4±0.3a2013.4±0.3b12.1±0.2b11.3±0.2b10.8±0.1b1011.7±0.2c9.8±0.2c10.2±0.2c9.1±0.1c對照(無菌生理鹽水)0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0

? 同列不同字母表示差異顯著 (P<0.01)。

當(dāng)紅皮火龍果皮多糖濃度為20 mg/mL時，對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈分別為13.4，12.1 mm。當(dāng)紅皮火龍果皮多糖濃度為40 mg/mL時，紅皮火龍果皮多糖對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑均>15 mm，而對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均<15 mm。總體來看，紅皮火龍果皮多糖對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性強于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

由表5可知，紅皮火龍果皮多糖對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為7.5 mg/mL時，未發(fā)現(xiàn)有大腸桿菌生長，因此確定大腸桿菌最小抑制多糖濃度為7.500 mg/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為30.000 mg/mL時，金黃色葡萄球菌不再生長，因而金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為30.000 mg/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中多糖濃度為45.000 mg/mL 時，蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌不再生長，確定蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑制多糖濃度為45.000 mg/mL。

表5 紅皮火龍果皮多糖的最小抑菌濃度?Table 5 Minimal inhibitory concentration (MIC) of the polysaccharide from red dragon fruit peel

? “+”表示有菌生長，“-”表示無菌生長。

3 結(jié)論

本試驗以紅皮火龍果為原料，采用過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色，考察了過氧化氫濃度、脫色溫度和脫色時間對紅皮火龍果皮多糖脫色的影響，確定過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖進行脫色的最佳工藝條件為：過氧化氫濃度4.3%，脫色溫度62 ℃，脫色時間109 min。紅皮火龍果皮多糖脫色率為88.17%，紅皮火龍果皮多糖保留率為82.39%。根據(jù)結(jié)果分析，采用過氧化氫法能對紅皮火龍果皮多糖進行有效脫色，且多糖保留率較高。同時，如何進一步采用過氧化氫對紅皮火龍果皮多糖脫色率和最大限度提高多糖保留率，仍有待進一步研究。另外，紅皮火龍果皮多糖對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用。這些結(jié)果證實，紅皮火龍果皮多糖具有良好的殺菌作用，將紅皮火龍果皮多糖進一步開發(fā)成食品添加劑具有良好的發(fā)展前景。

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