百藥煎中轉化鞣質生成沒食子酸的最佳菌種組合篩選△

胡夢，程玉冰，張培燕，劉英，胡海峰*

(1.上海醫藥工業研究院，上海 200040；2.國藥集團健康產業研究院有限公司，上海 201203)

百藥煎是我國傳統中藥飲片的一種，由五倍子、茶葉和酒曲等原料經自然發酵而成，臨床上多用于消化系統疾病的治療或調理。沒食子酸為百藥煎的主要藥效物質，由五倍子中的可水解鞣質經產單寧酶微生物轉化而來[1]，其具有抗腫瘤、殺錐蟲、抗炎、抑菌、抗病毒、降糖和降酯等活性[2]，其中百藥煎的傳統炮制是在自然狀態下由原料中所含微生物混合發酵而成，參與發酵的菌種和數量波動性較大，且易受致病菌及有害菌的污染，生產條件不易控制，產品質量隨環境變化波動較大，發酵終點憑主觀經驗判斷，因人而異，從而影響產品的質量和穩定性，不利于百藥煎工業化大規模生產[3]。為克服百藥煎傳統炮制的不足，本研究在前期分離并初步鑒定了百藥煎傳統炮制過程中微生物的基礎上，剔除致病菌后以藥效物質沒食子酸的含量變化為篩選指標，分別考察單菌及混菌發酵組合對百藥煎中鞣質轉化生成沒食子酸的能力，期望篩選得到協同降解鞣質生成沒食子酸的最佳混菌組合。

1 儀器與材料

1.1 樣品信息

百藥煎傳統炮制品由四川輔正藥業提供，鑒定人：河南中醫藥大學張振凌教授。五倍子(安徽亳州滬譙中藥飲片公司，批號：20160824)；綠茶(中國農業科學院茶葉專業市場)；酒槽(鎮江酒廠)；沒食子酸對照品(上海勃生物工程有限公司，純度99%以上)。樣品編號C1～C8分別是在發酵時間0、6、18、24、30、42、48、66 h取樣，樣品經60 ℃烘干3 h，打粉過40目篩。

1.2 菌種及細胞

百藥煎傳統炮制過程中所分離得到的菌種，紙片法初篩得到的細菌HMB1、HMB2、HMB3、HMB5、HMB6；酵母菌HMY1、HMY2、HMY5、HMY6、HMY7；絲狀真菌HMF1、HMF2、HMF3均具有降解鞣質能力，詳情見文獻[4]。金黃色葡萄球菌本實驗室保藏。

1.3 培養基

LB培養基、PDA培養基。1#液體培養基：2% C2粉末(m·v-1)，pH自然，裝液量30 mL，121 ℃滅菌30 min；2#固體培養基：25% C2粉末(m·v-1)，pH自然，2.5 g添加，121 ℃滅菌30 min；3#固體培養基：50%C2粉未(m·v-1)，PH自然，裝量5 g，121 ℃滅菌30 min。。

1.4 儀器

電子天平(上海精科天平)；精密數顯示酸度計(Sartorius)；壓力蒸汽滅菌鍋(上海華線醫用核子儀器有限公司)；超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；高效液相儀(Waters1525二元泵+2707自動進樣器+2998DAD檢測器)；離心機Avanti J-26 XP(BECK MAN CONLTER)。

2 方法

2.1 種子液制備

細菌用LB液體，酵母菌、絲狀真菌用PDA液體，在30 ℃下培養，150 r·min-1條件下培養12 h后，調整細菌、酵母菌活菌數為1×106CFU·mL-1，絲狀真菌菌體量達3 mg·mL-1。

2.2 搖瓶發酵篩選

液體搖瓶培養篩選降解1#培養基中鞣質生成沒食子酸能力較好的菌株及其與同類菌株和非同類菌株間協同作用較優的混菌組合。發酵搖瓶接種總量為2 mL，各菌接種比例相同，在30 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養6 d，HPLC測定發酵液中沒食子酸的量，以1#培養基為空白對照。

2.3 搖瓶篩選獲得最佳混菌組合固態發酵驗證

采用2#培養基進行固態發酵培養,驗證篩選菌株間協同降解鞣質生成沒食子酸的作用，每瓶接種總量為2 mL,不同菌株間接種比例相同,30 ℃條件下培養66 h測定發酵液中沒食子酸含量。

2.4 最佳混菌組合固態發酵時間曲線測定

最佳混菌組合的菌株接種于3#培養基中，細菌接種量各為0.2 mL、酵母菌接種量各為0.4 mL，分別于發酵0、18、30、42、48、66、72 h取樣測定發酵液中沒食子酸和鞣質的含量。

2.5 指標檢測

沒食子酸標準溶液配制：用甲醇配制沒食子酸，質量濃度為1.03 mg·mL-1標準品溶液。

供試液1的制備：分別精密稱取百藥煎炮制樣品(C1～C8)粉末各0.5 g，加水30 mL，稱重后浸提2 h，超聲提取2次，每次30 min，補足重量過濾。取濾液1 mL過0.45 μm濾膜后測定沒食子酸含量。

供試液2的制備：取20 mL供試液1，添加10 mL 12 mol·L-1濃鹽酸，振蕩混合均勻后，沸水浴30 min，取水解液1 mL于潔凈試管中，滴加明膠液1～2滴，若無白色沉淀出現，則表明鞣質水解完全，取濾液1 mL過0.45 μm濾膜過濾后測定沒食子酸含量。

可水解鞣質含量=水解后沒食子酸的含量-水解前沒食子酸含量[5]

(1)

沒食子酸HPLC檢測的色譜條件[6]：色譜柱Unitary C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(15∶85)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為273 nm；柱溫為30 ℃；進樣量20 μL。

2.6 樣品抑菌活性測定

供試液3制備：取百藥煎終樣品粉末0.5 g，加水10 mL，超聲提取30 min，過濾得百藥煎提取液。

抑菌活性檢測：LB制備金黃色葡萄球菌的菌濃約為1×106CFU菌懸液，取0.5 mL菌懸液，加至25 mL LB培養基振蕩混勻倒平板。滴加20 μL樣品提取液于直徑為3 mm的圓形紙片上，后于37 ℃培養2 d，測量紙片周圍抑菌圈直徑。

3 結果與分析

3.1 百藥煎傳統炮制過程中沒食子酸及鞣質含量變化

百藥煎傳統炮制過程中沒食子酸和鞣質含量變化見圖1。

圖1 百藥煎傳統炮制過程中沒食子酸和鞣質的含量變化

由圖1可知，隨百藥煎傳統炮制時間的增加，樣品中鞣質含量逐步減少，沒食子酸含量逐步增加，表明百藥煎中微生物逐步將鞣質轉化成沒食子酸。

3.2 鞣質降解菌株的篩選

通過摸索性實驗發現，菌株液體搖瓶篩選過程中，隨著培養時間的增加其代謝轉化鞣質生長沒食子酸量增多，造成培養基pH逐步降低，對菌株生長代謝影響較大，實驗發現，當接種量為2 mL時，能明顯縮短發酵周期至6 d。

3.2.1 單菌搖瓶篩選 分別單獨于1#液體培養基中接種各菌種子液各2 mL，在30 ℃、150 r·min-1條件下發酵培養6 d，后測定發酵液中沒食子酸的量，1#液體培養基為空白對照，結果見圖2 。

由圖2可知，單菌搖瓶培養發現，細菌HMB5、酵母菌HMY2分別是同類菌株中具轉化百藥煎中鞣質生成沒食子酸能力最強的菌株，而各絲狀真菌間能力對比差別不大。

圖2 單菌搖瓶培養篩選結果

3.2.2 同類菌株混合培養 分別將同類菌株中轉化百藥煎中鞣質生成沒食子酸能力最強單菌與其他同類菌株兩兩組合發酵培養，接種量各為1 mL，在30 ℃、150 r·min-1，發酵培養6 d后測定沒食子酸的量，以1#培養基和單菌發酵培養為對照，結果見圖3。

圖3 同類菌株混合搖瓶培養篩選

由圖3可知，搖瓶篩選發現細菌HMB2和HMB5，酵母菌HMY1和HMY2，絲狀真菌HMF2和HMF3的各組合中菌株具有相互協同增強降解百藥煎中鞣質生成沒食子酸的作用。

3.2.3 非同類菌株間混合培養

3.2.3.1 細菌、酵母菌混合培養 將細菌組合HMB5、HMB2與酵母菌組合HMY1、HMY2間分別進行三菌和四菌組合，接種于1#液體培養基中，每瓶接種總量為2 mL，各菌接種量比例相同，在30 ℃、150 r·min-1，培養6 d后檢測發酵液中沒食子酸的量，以同類菌株混合發酵為對照，結果見圖4。

圖4 細菌酵母菌混合培養結果

由圖4可知，菌株HMB2、HMB5、HMY1、HMY2間具有協同增強轉化百藥煎鞣質成沒食子酸的作用。

3.2.3.2 細菌、酵母菌、絲狀真菌混合培養 分別將混菌HMB2、HMB5、HMY1、HMY2與最優絲狀真菌組合HMF2、HMF3間進行組合，接種于1#培養基中，每瓶接種總量為2 mL，各菌接種量比例相同，在30 ℃、150 r·min-1，發酵培養6 d后檢測發酵液中沒食子酸的量，結果見圖5。

圖5 最優細菌酵母菌組合與絲狀真菌混合搖瓶培養

由圖5可知，絲狀真菌HMF2、HMF3與最優細菌酵母菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2間具有拮抗轉化百藥煎鞣質生成沒食子酸作用。因此搖瓶發酵篩選得到的組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2為轉化百藥煎鞣質生成沒食子酸的最佳混菌組合。

3.3 搖瓶篩選獲得最佳混菌組合固態發酵驗證

分別將最強單菌HMB5和HMY2、最佳細菌混菌組合(HMB1與HMB5)、最佳酵母菌混菌組合(HMY1與HMY2)、最佳混菌組合(HMB5、HMB1、HMY1和HMY2)接種于2#固態發酵培養基中，接種總量為2 mL，各菌株接種比例相同，在30 ℃條件下靜置培養66 h，結束后檢測發酵物中沒食子酸的含量，結果見圖6。

圖6 最優混菌組合固態發酵培養

由圖6可知，最佳混菌HMB2、HMB5、HMY1、HMY2組合固態發酵培養協同轉化百藥煎中鞣質生成沒食子酸的能力優于最強單菌及最優同類混菌組合。

3.4 最佳混菌組合固態發酵時間曲線

初步研究了最佳混菌組合固態發酵相關條件，包括接種量、菌株接種比例和底物濃度的影響，研究結果發現，菌株接種于3#培養基，細菌接種量各為0.2 mL、酵母菌接種量各為0.4 mL時發酵效果最好，因此在該發酵條件下分別于發酵0、18、30、42、48、66、72 h取樣測定發酵液中沒食子酸和鞣質隨時間的變化情況，結果見圖7。

由圖7可知，百藥煎最佳混菌組合固態發酵過程中，隨著發酵時間的增加鞣質含量呈遞減趨勢，沒食子酸的含量呈先增加后減少趨勢，培養至66 h樣品中沒食子酸含量最大為0.589 g·g-1樣品，優于百藥煎傳統炮制品中沒食子酸含量(0.52 g·g-1樣品)。

圖7 最優混菌組合固態發酵培養過程中沒食子酸和鞣質含量變化

3.5 百藥煎傳統炮制品和百藥煎最佳混菌發酵樣品抑菌活性測定

比較測定百藥煎傳統炮制品和百藥煎的最佳混菌組合固態發酵培養至66 h，各樣品對金黃色葡萄球菌的抑制活性，結果見圖8。

圖8 百藥煎炮制品和發酵樣品抑菌活性測定

由圖8可知，百藥煎最佳混菌固態發酵66 h所得樣品對金黃色葡萄球菌抑制活性優于百藥煎傳統炮制品。

4 討論

百藥煎傳統炮制飲片是在自然狀態下混菌發酵制成，隨著炮制時間的增加樣品中鞣質含量呈遞減趨勢，沒食子酸的含量則呈遞增趨勢，該結果表明，百藥煎中所含微生物逐步將鞣質轉化成沒食子酸。因此本實驗以百藥煎傳統炮制過程中分離純化獲得具降解鞣質能力的微生物作為篩選出發菌種庫，分別進行單菌發酵和混菌發酵，以HPLC方法檢測發酵液中沒食子酸或鞣質的含量，搖瓶篩選得到具協同降解鞣質生成沒食子酸的能力的最佳混菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2。最佳混菌組合固態發酵后樣品中沒食子酸的量約為0.59 g·g-1百藥煎，而百藥煎傳統炮制品中沒食子酸為0.52 g·g-1百藥煎，增加了約11%，且最佳混菌固態發酵后樣品對金黃色葡萄球菌的抑制活性優于百藥煎傳統炮制品。

本研究篩選得到最佳混菌組合HMB2、HMB5、HMY1、HMY2不僅為實現百藥煎的現代工業化生產提供了可發酵調控菌種基礎，同時也為分離并利用傳統發酵中藥的微生物提供了一定的參考。

[1] 江蘇新醫學院.中藥大辭典：上冊[M].上海：上海科學技術出版社，2001.

[2] 柯以敏，張開蓮.沒食子酸的研究進展[J].瀘州醫學院學報，2011，30(4)：440-442.

[3] 李弈，萬德光.試論傳統中藥的發酵炮制[J].成都醫學院學報，2006，1(2)：99-101.

[4] 胡夢，王瑞生，文雯，等.百藥煎傳統炮制過程中微生物的分離與初步鑒定及其鞣質水解特性研究[J].中國現代中藥，2017，19(8)：1120-1125.

[5] 王廣娟.五倍子沒食子酸的提取、純化及抑菌效果研究[D].保定：河北農業大學，2010.

[6] 肖芳，黃勤挽，易佳佳.百藥煎質量標準研究[J].中藥與臨床，2016，7(4)：18-21.