三聚磷酸鹽提高羅非魚魚糜抗凍性研究

張文婷，李婕，陳健

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

近年來(lái)，羅非魚因其肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩，逐漸替代傳統(tǒng)白肉魚，日漸受到歐美市場(chǎng)的青睞，尤其是羅非魚冷凍魚糜[1-2]。但是魚糜中的蛋白質(zhì)在冷凍和冷藏的過(guò)程中，容易發(fā)生冷凍變性，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)[3-4]。向魚糜蛋白制品加入抗凍劑可以有效防止魚糜蛋白的變性，目前常用卵磷脂、蔗糖和磷酸鹽等作為抗凍保護(hù)劑。卵磷脂和蔗糖因甜度和熱量高，影響了魚糜及其制品的口味和健康營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。磷酸鹽尤其是三聚磷酸鹽對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，添加在食品中能有效防止蛋白質(zhì)變性、淀粉老化，抑制臭味、腐腥味的產(chǎn)生[7-9]。

三聚磷酸鹽為白色結(jié)晶粉末，在水中極易溶解，黏著性很強(qiáng)，1%水溶液的pH值為9.5[10]。添加少量三聚磷酸鹽，就能對(duì)肉制品起到很好護(hù)色、預(yù)防變質(zhì)和分散的功效，還能增強(qiáng)脂肪的乳化性。添加三聚磷酸鈉的肉制品，水分在高溫加熱后流失少，成品完整度較好、色澤無(wú)差異、肉質(zhì)柔嫩，容易切片，切面有光澤，是應(yīng)用最多的一種磷酸鹽，最大使用量為1%。三聚磷酸鹽還具有安全、無(wú)毒、易降解的性質(zhì)，因此三聚磷酸鹽可以作為優(yōu)良的抗冷凍變性劑在食品工業(yè)中大量應(yīng)用[11-12]。為了抑制冰晶的增長(zhǎng)速率和形態(tài)學(xué)不穩(wěn)定性，Enjakul等[13]通過(guò)原位觀察的實(shí)驗(yàn)方法證明了三聚磷酸鹽比蔗糖的效果更好。Kingduean等研究證實(shí)鯔魚中Ca2+-ATP酶的活性只需0.5%的三聚磷酸鹽即可完全抑制，并且最大限度的保持水分不凍結(jié)[14]。郭穎等在魷魚魚糜中加入3種磷酸鹽，發(fā)現(xiàn)焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉和三聚磷酸鈉添加量各為0.30%時(shí)，魚糜的硬度、彈性達(dá)到最大[15]，由此證明了磷酸鹽的優(yōu)良特性。

三聚磷酸鹽具有保護(hù)蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)，保持食品風(fēng)味和質(zhì)地的效果[10]。同時(shí)，三聚磷酸鹽作為抗凍劑，可以避免添加甜度較高的抗凍劑例如蔗糖、山梨醇等使魚糜的甜度增加，從而影響產(chǎn)品風(fēng)味[16]。本試驗(yàn)著重探討三聚磷酸鹽對(duì)冷凍羅非魚魚糜中蛋白質(zhì)的保護(hù)作用，為將三聚磷酸鹽作為冷凍魚糜的抗凍保護(hù)劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚（每條魚約500 g）：?？谑醒亟龞|路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

三聚磷酸鹽（純度≥99%）、磷酸鹽緩沖溶液：北京索萊寶科技有限公司；Weber-Edsall溶液、雙縮脲試劑：廣州化學(xué)試劑廠；Tris-maleate溶液：南京森貝伽生物科技有限公司；ATP酶檢測(cè)試劑盒：南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機(jī)（DS-1）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（TDZ5-WS）：上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計(jì)（UV1700型）：日本島津公司；冰箱（BD-80）：青島海爾電冰箱股份有限公司；電子天平（SHIMADZU AUW220）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜制作流程

活羅非魚→前處理（去鱗）→流水洗凈→采肉→漂洗→脫水→打漿→添加三聚磷酸鹽（添加量依次為0%、0.1%、0.3%、0.6%）→混勻→密封→-18℃凍藏

1.3.2 鹽溶性蛋白含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量并充分研碎成為魚糜制品的羅非魚，加入10倍體積（離子強(qiáng)度=0.05，pH=7.5）的磷酸鹽緩沖溶液，提取5 min，在4 000 r/min下離心5 min，去上清液，重復(fù)上述步驟兩次，取離心后的沉淀魚糜加入10倍量的Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl-0.01 mol/L Na2CO3-0.04 mol/L NaHCO3），在 4℃下浸提20 h，4 000 r/min下離心7 min，測(cè)量上清液的體積，蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測(cè)定[17]。

1.3.3 制備肌原纖維蛋白溶液

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜制品，加入10倍體積pH=7.0，內(nèi)含0.05 mol/L KCl的20 mmol/LTrismaleate緩沖液，充分勻漿1 min，在6 000 r/min的條件下低溫離心10 min，洗去魚糜樣品中殘留水溶性蛋白質(zhì)。棄上清液，向沉淀魚糜中加入10倍體積的pH=7.0，內(nèi)含 0.6 mol/L KCl的 20 mmol/L Tris-maleate緩沖液，充分勻漿1 min后在4℃下浸提1 h，然后在6 000 r/min，4℃下離心10 min，上清液即為試驗(yàn)用肌原纖維蛋白溶液[18]。

1.3.4 肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性測(cè)定

肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力利用ATP酶檢測(cè)試劑盒，在低離子強(qiáng)度下加入0.06 mol/L KCl、pH=7.0的25 mmol/LTris-maleate溶液測(cè)定。向0.2 mg/mL～0.4 mg/mL肌原纖維蛋白中加入1 mmol/L ATP和5 mmol/L CaCl2，混合物在25℃下反應(yīng)5 min，最后將0.5 mL高氯酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%）加入2 mL反應(yīng)液中來(lái)結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)中釋放的無(wú)機(jī)磷含量通常是采用鉬酸銨法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，Ca2+-ATP酶活力用25℃恒溫條件下，每分鐘1 mg蛋白質(zhì)所生成的無(wú)機(jī)磷的微摩爾數(shù)表示[19]。

式中：A為1 mL反應(yīng)液生成的磷酸量，μmol；B為空白值，μmol；t為反應(yīng)時(shí)間，min；酶蛋白質(zhì)量為 1 mL反應(yīng)液所含的酶量，mg。

1.3.5 自由液滴和加熱液滴損失

參考文獻(xiàn)[20]的方法，并稍微改動(dòng)。

1.3.5.1 自由液滴測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜，立刻放入含有濾紙的培養(yǎng)皿中，密封在8℃～10℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后取出，用濾紙拭去魚片表面的液體，立即稱重，根據(jù)公式2計(jì)算自由液滴損失。

1.3.5.2 加熱液滴測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜，放入具有蓋子的鋁質(zhì)小盒內(nèi)，用沸水蒸蓋緊的鋁制小盒10 min，取出后將試樣放入帶銅網(wǎng)的離心管，2 500 r/min下離心10 min后稱取魚糜重量，根據(jù)公式3計(jì)算加熱液滴損失。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚糜凍藏過(guò)程中鹽溶性蛋白含量的變化

羅非魚魚糜分別用4組不同濃度的三聚磷酸鹽處理，并在-18℃條件下冷藏8周，每周觀察一次鹽溶性蛋白的含量變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 羅非魚魚糜鹽溶性蛋白在凍藏過(guò)程中含量變化Fig.1 The change of salt-soluble protein content in tilapia surimi during frozen storage

經(jīng)過(guò)三聚磷酸鹽處理過(guò)魚糜的鹽溶蛋白含量下降率明顯低于對(duì)照組（0%三聚磷酸鹽）（P＜0.05）。在對(duì)照組中，從開始的第1周到第4周期間，鹽溶蛋白含量由84.12%下降到54.27%，下降率達(dá)到35.49%，而對(duì)于分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸鹽處理后的試驗(yàn)組，下降率分別是32.20%、14.12%和12.13%。由此可說(shuō)明，鹽溶蛋白的含量在前4周都呈快速下降趨勢(shì)，但添加三聚磷酸鹽的各組下降率比對(duì)照組低，并呈濃度依賴關(guān)系。在第4周到第8周期間，各組中的鹽溶性蛋白含量均平緩下降。對(duì)照組的鹽溶性蛋白含量在第8周已經(jīng)下降到原來(lái)的52.32%，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽試驗(yàn)組下降率分別是46.58%、30.16%和27.98%。圖1結(jié)果表明三聚磷酸鹽具有降低魚糜制品在凍藏過(guò)程中鹽溶性蛋白的損失，對(duì)蛋白質(zhì)有顯著的冷凍保護(hù)作用。從圖1中還可看出，0.1%三聚磷酸鹽效果要顯著低于0.3%和0.6%，同時(shí)0.3%和0.6%三聚磷酸鹽對(duì)鹽溶性蛋白的溶出量相差僅為2.18%，因此從降低生產(chǎn)成本方面考慮，冷凍前的羅非魚魚糜采用0.3%三聚磷酸鹽處理。

冷凍魚糜的主要成分是肌原纖維蛋白質(zhì)，但在凍藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成氫鍵、二硫鍵、疏水鍵和鹽鍵，它們相互反應(yīng)而產(chǎn)生聚集變性，導(dǎo)致鹽溶性下降，從而使魚糜制品的蛋白變性，產(chǎn)品出現(xiàn)問(wèn)題[21-22]。三聚磷酸鹽之所以能提高蛋白質(zhì)的抗凍性，可能是由于蛋白質(zhì)分子中的某些基團(tuán)可以與三聚磷酸鹽中的羥基發(fā)生反應(yīng)，減少了蛋白質(zhì)分子之間因官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的聚集變性[6]。另外三聚磷酸鹽具有高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，可減少冰晶體形成量，減緩蛋白質(zhì)分子的相互聚集，間接地對(duì)蛋白質(zhì)起保護(hù)作用[8]。

2.2 凍藏過(guò)程中魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性變化

衡量魚糜在冷凍貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)是Ca2+-ATP酶活性，活性值越高，表明魚糜蛋白質(zhì)性質(zhì)越穩(wěn)定，冷凍變性程度越小，品質(zhì)也越好[23-24]。凍藏過(guò)程中魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性變化見圖2。

圖2 羅非魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性在凍藏過(guò)程中含量變化Fig.2 The change of Ca2+-ATP activity in myofibrillar protein of tilapia surimi during frozen storage

由圖2可知，羅非魚魚糜在-18℃凍藏30 d后，所有組魚糜中的肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力均呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組（0%三聚磷酸鹽）中該酶活力在凍藏前為0.82 μmol/（mg·min），而凍藏后只有0.23 μmol/（mg·min），下降率高達(dá)71.95%；而0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽組，其肌原纖維蛋白中Ca2+-ATP酶活性分別由最開始的0.84、0.89、0.91 μmol/（mg·min）下降到0.29、0.42、0.47 μmol/（mg·min），下降率分別為65.48%、52.80%和48.35%。試驗(yàn)結(jié)果表明，三聚磷酸鹽的加入能減少肌原纖維中Ca2+-ATP酶活性的下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，分別經(jīng)0.3%和0.6%三聚磷酸鹽溶液浸漬處理的試驗(yàn)組對(duì)Ca2+-ATP酶活性影響差別不大。因此，考慮成本因素，選擇0.3%三聚磷酸鹽浸泡羅非魚魚糜后再冷凍，可使魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性程度小。

2.3 凍藏過(guò)程中魚糜液滴損失

凍藏過(guò)程中魚糜液滴損失見圖3、圖4。由圖3所示，不同濃度三聚磷酸鹽溶液處理后的凍藏羅非魚魚糜，隨著凍藏時(shí)間的增加自由液滴的損失，均明顯低于對(duì)照組，持水能力得到大的改善。凍藏30 d后，對(duì)照組（0%三聚磷酸鹽）自由液滴損失為3.19%，而0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸鹽組的液滴損失分別為3.04%、1.21%和1.15%。繼續(xù)凍藏到60 d后，添加三聚磷酸鹽的3個(gè)組中自由液滴損失分別為對(duì)照組的81.41%、36.91%和35.60%。

由圖4結(jié)果可知，羅非魚魚糜先經(jīng)過(guò)三聚磷酸鹽溶液處理再冷凍，在凍藏過(guò)程中加熱液滴損失均小于對(duì)照組（0%三聚磷酸鹽）。凍藏60 d后質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽組的加熱液滴損失分別為38.57%、31.14%和32.02%，只有對(duì)照組的93.53%、75.51%和77.64%。由上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羅非魚魚糜凍藏過(guò)程中，加入三聚磷酸鹽能有效的減少魚糜的液滴損失。

圖3 羅非魚魚糜在凍藏過(guò)程中的自由液滴損失Fig.3 The change of free droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

圖4 羅非魚魚糜在凍藏過(guò)程中的加熱液滴損失Fig.4 The change of heating droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

3 結(jié)論

羅非魚魚糜用0.3%三聚磷酸鹽處理后，鹽溶性蛋白損失明顯減少，肌原纖維蛋白中Ca2+-ATP酶活性的下降率較低，并能減輕魚糜的液滴損失，對(duì)羅非魚魚糜蛋白質(zhì)的冷凍變性有明顯的保護(hù)作用，可作為魚類蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)物質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]賈麗娜,龐杰,吳云輝,等.乳化油脂與羅非魚肌原纖維蛋白復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(2):121-125

[2]賴燕娜,傅亮,賴雄偉,等.咸鴨蛋蛋清對(duì)羅非魚魚糜凝膠品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技,2012(1):82-84,87

[3]Hunt A,Park JW.Comparative study of sodium bicarbonate on gelling properties of alaska pollock surimi prepared at different freezing rates[J].Journal of Food Quality,2014,37(5):349-360

[4]Jin YB.The effect of cryoprotectants on the properties of pacific sand lance ammodytes personatus girard surimi during frozen storage[J].Fisheries and Aquatic Sciences,2014,17(3):291-298

[5]Wu S.Effect of trehalose on the state of water,protein denaturation and gel-forming ability of weever surimi[J].International Journal of Food Properties,2016,19(3):521-525

[6]胡耀輝,鄭微微,李琢偉,等.三聚磷酸鹽對(duì)防止鯉魚魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性的研究[J].食品科學(xué),2011,32(9):126-129

[7]Wang HB,Pan SK,Wu SJ.Chitooligosaccharides suppress the freeze-denaturation of actomyosin in Aristichthys nobilis surimi protein[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,63:104-106

[8]張麗杰,張雪蓮,邸進(jìn)申.新型食品添加劑海藻糖的發(fā)展前景[J].中國(guó)食品添加劑,2004(2):61-65

[9]胡坤,李棟燕,余烈輝.多糖與磷酸鹽對(duì)草魚魚糜凝膠特性影響的研究[J].肉類工業(yè),2010(5):12-15

[10]周愛(ài)梅,潘珂,黃文華,等.幾種添加劑對(duì)鳙魚魚糜凝膠特性的影響[J].食品科學(xué),2004,25(8):50-53

[11]徐萌,劉瑋,周黎,等.離子色譜法研究多聚磷酸鹽在肌肉中的動(dòng)態(tài)水解變化[J].食品科學(xué),2016,37(19):36-41

[12]田銳花,盧桂松,彭增起,等.三聚磷酸鈉水解對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離和凝膠特性的影響[J].食品科學(xué),2013,34(15):126-130

[13]Benjakul S,Visessanguan W.Transglutaminasemediated setting in bigeye snapper surimi[J].Food Research International,2003,12(36):253-266

[14]Kingduean S,Yaowalux R.The cryoprotectant effect of shrimp chitin and shrimp chitin hydrolysate on denaturation and unfrozen water of lizard fish surimi during frozen storage[J].Food Research International,2005,38(6):345-355

[15]郭穎,孟珺,常忠義,等.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和磷酸鹽對(duì)魷魚魚糜凝膠性能的影響[J].食品科學(xué),2012,33(19):178-181

[16]劉欣,周愛(ài)梅,趙力超,等.海藻糖、乳酸鈉對(duì)凍藏鳙魚魚靡蛋白抗凍效果的影響.食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(8):60-64

[17]從浩.利用羅非魚和鮰魚及其副產(chǎn)物加工魚糜凝膠食品的技術(shù)研究[D].武漢:武漢工業(yè)學(xué)院,2012

[18]黃金發(fā).羅非魚魚糜質(zhì)構(gòu)特性及綜合加工利用[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2013

[19]石金明,靳紅果,彭增起,等.肌肉焦磷酸酶和三聚磷酸酶的特性與應(yīng)用[J].肉類研究,2011,25(11):47-49

[20]翁世兵,林琳,張靜雅,等.斬拌加鹽量對(duì)白鰱魚糜物理特性的影響[J].肉類工業(yè),2012,354(10):25-28

[21]胡素巧,張麗娜,羅永康,等.冷巧和微凍條件下鯉魚品質(zhì)變化的研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2010,37(5):38-42

[22]任宏偉,胡柳.我國(guó)魚靡制品現(xiàn)狀及發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國(guó)水產(chǎn),2010(8):25-26

[23]于琴芳,鄧放明.鰱魚、小黃魚、鱈魚和海鰻肌肉中營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2012(9):9-14

[24]林琳,陸劍峰,翁世兵,等.漂洗工藝對(duì)鏈魚魚靡凝膠強(qiáng)度和色澤的影響[J].食品研究與開發(fā),2012,33(2):8-11