ALCAM基因1沉默對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制

活化白細(xì)胞黏附分子(actived leukocyte cell adhesionmolecule，ALCAM)，又稱CD166和MEMD，是一種廣泛存在于人體組織器官的跨膜糖蛋白受體，主要表達(dá)于白細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞，是免疫球蛋白基因超家族成員，具有廣泛生理病理功能[1-2]。臨床數(shù)據(jù)[3-5]顯示，ALCAM的表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤的惡性程度和臨床分期有關(guān)，這表明在腫瘤細(xì)胞中ALCAM的高表達(dá)反映了腫瘤的惡性程度，并且可以預(yù)示腫瘤的浸潤和疾病進(jìn)展。近年來，有研究[6]表明，ALCAM在胃癌的表達(dá)可能參與了腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究通過構(gòu)建ALCAM shRNA表達(dá)質(zhì)粒，抑制ALCAM基因表達(dá)，觀察其對人胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)活性的影響，為胃癌的治療找到新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人胃癌細(xì)胞SGC-7901由鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科凍存；質(zhì)粒pGenesil-1-ALCAM shRNA和pGenesil-1-control shRNA(非特異性shRNA)由鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科構(gòu)建并驗(yàn)證；總RNA提取試劑盒(DP405)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR103)購自天根生化科技有限公司；2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Q111)購自南京諾唯贊生物有限公司；兔抗人CD166單克隆抗體[EPR2759(2)]購自美國Abcam公司；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)多克隆抗體(4272)、AKT多克隆抗體(Ser473)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein，mTOR)多克隆抗體(2972)和mTOR多克隆抗體(Ser2448)購自美國CST公司；Caspase-3單克隆抗體(3F49)購自美國Santa cruz公司；CCK-8試劑盒(C0037)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1063)購自碧云天生物技術(shù)研究所。6～8周裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 人胃癌細(xì)胞SGC-7901培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取凍存的人胃癌細(xì)胞SGC-7901，37.0℃水浴箱快速振蕩融化，加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，800 r/min，離心半徑17.39 cm，離心時(shí)間 5 min；棄上清液，加入含10% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)基；重懸后接種于培養(yǎng)皿中；重懸細(xì)胞后分裝，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長至90%融合度時(shí)，胰酶消化傳代培養(yǎng)，按5×106個(gè)細(xì)胞密度接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合；將細(xì)胞分為兩組：ALCAM shRNA組和對照shRNA組，分別將重組質(zhì)粒pGenesil-1-ALCAM shRNA和pGenesil-1-control shRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合后加入培養(yǎng)皿中，充分混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6 h后更換10% FBS的 RPMI 1640 培養(yǎng)基；24 h 后向培養(yǎng)皿內(nèi)加入含有 1.5 mg/mL G418 的完全培養(yǎng)液；3 d換液1次，待培養(yǎng)板內(nèi)可看到單克隆，換成無抗菌藥物的完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞病變及綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.3 RT-PCR檢測ALCAM mRNA表達(dá)水平 待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌；加入Trizol溶液1 mL，充分混勻，靜置5 min；用移液管將細(xì)胞懸液移入EP管中，加0.2 mL氯仿，充分振蕩后室溫靜置 5 min；4℃，12 000 r/min，離心半徑17.39 cm，離心15 min；將上層水相移至新的EP管，加等體積異丙醇，充分混勻冰上靜置10 min；4℃，12 000 r/min，離心10 min；棄上清，加入等體積75%的乙醇洗滌；4℃，8 000 r/min，離心10 min；棄上清，冰上干燥10 min；DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)測定 RNA 溶液濃度；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。設(shè)計(jì)ALCAM引物如下：5’-TTTTACTTACCAGGACAGC-3’(ALCAM-F)，5’-GACATAGTTTCCAGCATC-3’(ALCAM-R)，5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’(GAPDH-F)，5’- GC GCCCAATACGACCAAATC -3’(GAPDH-R)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green master mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1.25 μL，用雙蒸水補(bǔ)至20 μL；反應(yīng)條件：95℃ 3 min 預(yù)變性，95℃ 30 s變性，50℃ 30 s退火延伸，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min；讀取數(shù)據(jù)，定量分析；2% 瓊脂糖凝膠電泳分析確定PCR產(chǎn)物。

1.4 Western blot檢測ALCAM蛋白表達(dá)水平 待細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次；加入1 mL預(yù)冷RIPA 蛋白裂解緩沖液，冰上裂解15 min；4℃，12 000 r/min，離心半徑17.39 cm，離心15 min；取上清即總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度；取EP管，分別加入各組蛋白樣品；加入Loading Buffer 混勻，煮沸10 min，變性；10%SDS-PAGE電泳分離；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%的BSA封閉30 min；兔抗人CD166單克隆抗體4℃孵育過夜；PBST洗滌2次，每次5 min；鼠抗兔IgG單克隆抗體室溫孵育1 h；PBST洗滌2次，每次5 min；DAB顯色，拍照。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參抗體，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析計(jì)算各組細(xì)胞中ALCAM蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 CCK-8法檢測胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖情況 所有步驟嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行；分別取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104/mL，接種至96 孔板，每孔100μL，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔；在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，繪制生長曲線。

1.6 ALCAM蛋白對胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響 將ALCAM shRNA和對照shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC-7901胃癌細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL，分別于10只裸鼠腋下脂肪墊接種細(xì)胞100 μL，在接種后第12天，采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長和寬，并按照公式V=1/2(長×寬)計(jì)算腫瘤體積。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡水平 分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞，置于流式管中，PBS洗滌2次；1 000 r/min，離心半徑17.39 cm，離心5 min；加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞；分別加入5 μL Annexin V-FITC和 PI Staining Solution，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻；在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，以未轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率。

1.8 ALCAM蛋白介導(dǎo)的下游信號通路分析 采用Western blot分析AKT-mTOR信號通路的激活以及凋亡信號通路相關(guān)的表達(dá)水平。Western blot操作方案按照1.4方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 ALCAMshRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞 經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到3組細(xì)胞有80%以上的細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)。詳見圖1。

圖1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后SGC-7901細(xì)胞(×10)

2.2 ALCAM mRNA表達(dá)水平比較 與對照 shRNA組比較，ALCAM shRNA組細(xì)胞ALCAM mRNA電泳條帶減弱。定量分析結(jié)果顯示，與對照 shRNA組(1.01±0.26)比較，ALCAM shRNA組細(xì)胞ALCAM mRNA(0.12±0.06)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.918,P<0.001)。詳見圖2。

2.3 ALCAM蛋白表達(dá)水平比較 與對照shRNA組(1.66±0.23)比較，ALCAM shRNA組細(xì)胞ALCAM蛋白表達(dá)水平(0.23±0.09)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.019,P<0.001)。詳見圖3。

圖2 ALCAM mRNA表達(dá)水平比較

圖3 ALCAM蛋白表達(dá)水平比較

2.4 增殖和體內(nèi)腫瘤生長比較 與對照 shRNA組比較，ALCAM shRNA組細(xì)胞增殖活性下降，生長速率緩慢(F=3.154，P=0.014)。與對照shRNA組比較，ALCAM shRNA組腫瘤生長速度降低(F=4.094，P=0.004)。詳見表1、2。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力比較

表2 兩組細(xì)胞在體內(nèi)成瘤后體積變化比較

2.5 細(xì)胞凋亡水平比較 Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果示，ALCAM shRNA組細(xì)胞凋亡率為(23.65±6.82)%，高于對照shRNA組的 (2.41±0.82)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.871,P<0.001)。

2.6 ALCAM敲低對AKT、mTOR和凋亡蛋白Caspase-3的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對照shRNA組比較，ALCAM shRNA組細(xì)胞AKT和mTOR磷酸化水平下調(diào)。詳見圖4。

圖4 ALCAM敲低對AKT-mTOR和凋亡蛋白Caspase-3的影響

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，臨床上大部分患者發(fā)現(xiàn)胃癌時(shí)已處于進(jìn)展期或晚期，手術(shù)切除效果不佳，傳統(tǒng)的放化療效果亦不理想，5年生存期低于50%，預(yù)后較差[7]。胃癌細(xì)胞的生長、增殖、凋亡及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性事件受到多種分子的調(diào)控，尋找敏感而特異的腫瘤標(biāo)志物，特別是分子標(biāo)志物，從分子水平上研究胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，了解胃癌發(fā)生發(fā)展過程中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，將為找到有效的治療策略提供理論基礎(chǔ)[8-9]。

ALCAM廣泛分布于活化的白細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等細(xì)胞中。ALCAM參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、造血、外周及中樞系統(tǒng)發(fā)育以及腫瘤的侵襲[10]。自發(fā)現(xiàn)以來，ALCAM已被證實(shí)高表達(dá)于乳腺癌、前列腺癌、食管癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞表面，可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。研究[11-12]顯示，ALCAM與患者的生存、復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究在細(xì)胞水平上分析了ALCAM蛋白對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示，ALCAM敲低的細(xì)胞增殖明顯減緩，而細(xì)胞凋亡水平則顯著增高，說明ALCAM可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。AKT-mTOR信號通路是細(xì)胞增殖主要的信號通路之一，其也在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ALCAM敲低后AKT和mTOR總蛋白水平表達(dá)無差異，但是AKT和mTOR磷酸化的水平明顯下降，這一結(jié)果提示ALCAM可能通過AKT-mTOR信號通路發(fā)揮功能。腫瘤組織中ALCAM蛋白的高表達(dá)可能導(dǎo)致AKT-mTOR信號通路的過度激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快，當(dāng)ALCAM敲低時(shí)細(xì)胞生長減慢。此外，筆者發(fā)現(xiàn)ALCAM蛋白敲低的細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)水平明顯增加。Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中主要的執(zhí)行分子，可以剪切下游很多蛋白，激活凋亡信號通路[14]。Caspase-3蛋白水平的上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一結(jié)果與ALCAM蛋白敲低后細(xì)胞凋亡增加的細(xì)胞生物學(xué)表型一致。

綜上所述，ALCAM基因沉默能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖速率，并增加其凋亡率，為研發(fā)胃癌新的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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