頂花板凳果愈傷組織和芽誘導培養研究

張 萍，王 森，付國贊，蔣建林，唐 艷

（1.中南林業科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室/經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.河南林業職業學院園林系，河南 鄭州 471002）

頂花板凳果（Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc.）也稱粉蕊黃楊（中國樹木分類學）或頂蕊三角咪（中國高等植物圖鑒）［1］。黃楊科板凳果屬常綠亞灌木，莖稍粗壯，下部根莖狀且布滿長須狀不定根，上部直立。葉薄革質，菱狀倒卵形，似簇生狀。花序穗狀，白色，頂生。果卵形，長5～6 mm，花期為4～5月，產于甘肅、陜西、四川、湖北、浙江等地，日本也有分布［2］。生于海拔1 000～2 600 m山區雜林或溝谷，喜陰濕耐寒，呈零星團塊狀分布［1］。

頂花板凳果是“陜西七藥”中的重要藥材之一，全草可入藥，味苦微辛，可作為治療老年慢性支氣管炎、風濕性關節炎等疾病的復方藥［3］。國內外學者對頂花板凳果的化學成分進行了大量研究。1975年日本學者Kikuchi［4］首次從頂花板凳果中分離出的Pachysandra型孕甾烷甾體生物堿具有很好的抗腫瘤活性藥效。2000年美國學者Funayama S等［5］從頂花板凳果中分離得到一個新化合物pachysamine-E（19）。2014年，王嘯洋［6］從陜西產頂花板凳果中分離得到7個生物堿，包括3個新化合物：1α-6α，10β-dihydroxy-2，3，7，7，10α-pentamethyl-2-azabicyclo-［4，3，1］decan-9-one（38）、20α-dimethylamino-3β-senecioylamino-16β-hydroxy-pregn-5-ene（39）和 20α-dimethylamino-3βsenecioylamino-pregn-5-ene（40）。2016年，段宏泉［7］課題組從頂花板凳果中分離出9個新富貴草型生物堿（terminamines-K-S ）（42-50）。

頂花板凳果植株低矮，四季常青，生長旺盛，競爭力強，吸收有害氣體能力強，免修剪，易管理，養護成本低，既可作為園林綠化地被植物，又可作室內盆栽觀賞植物，目前在江蘇、北京、上海等地已有引種開發利用［8］。嚴海燕［9］研究表明，頂花板凳果具有耐陰性較強、光適應性范圍較廣且抵抗低溫寒冷的高度適應性的生理生化功能。楊淑紅等［10］研究表明，林緣與林下交界處的BD2和BD4葉片中各種葉綠素含量均顯著高于其他葉片，證明頂花板凳果喜半陰環境，宜栽植在林緣、半林下、陰坡及建筑物北側半陰處，可與喬、灌木構成復層次綠化，起到良好的水土保持作用。于洋等［11］研究表明，頂花板凳果耐旱性最強，夏季可耐15～20 d干旱。

頂花板凳果生產上常用播種繁殖、分株繁殖、切莖扦插繁殖、壓條繁殖［12］。王小平等［13］指出選沙質壤土和或河沙作為基質，6～7月間進行扦插，當年即可成為商品苗，經濟效益高。但有關頂花板凳果的組織培養育苗少有報道，僅程水金等［14］研究富貴草（頂花板凳果）的離體快繁結果表明，小莖段在MS+6BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中分化率最高，在1/2 MS+NAA 0.1 mg/L的生根效果最好，但未對組織培養的具體條件做詳細探討。植物細胞組織培養技術是一種能滿足現代化農業需求的快速、便捷的繁殖方法［15］。本試驗在前期研究基礎上進一步探討不同培養條件對頂花板凳果植物組織培養的影響，為頂花板凳果的組織培養育苗工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2016年11月河南省洛陽市欒川縣赤土店熊耳山采挖栽植頂花板凳果的當年生鮮嫩帶芽莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同外植體采樣時間下的頂花板凳果組織培養情況測定 將在1月2日、3月3日、5月6日、6月2日采集的外植體，在同樣培養條件下進行頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導。每個處理30個樣本，3次重復。對試驗結果進行觀察記錄，統計外植體污染率、愈傷組織和芽的誘導率及生長情況。

1.2.2 不同消毒方式下頂花板凳果組織培養情況測定 取當年生鮮嫩帶芽頂花板凳果莖段，用軟毛刷輕輕刷洗莖部及腋芽處，用中性洗滌劑浸泡30 min，用流水沖洗4～6 h，置于無菌超凈工作臺上，備用。先用70%酒精消毒1 min，用無菌水沖洗3～4次，接著用滅菌劑浸泡，浸泡處理的時間按照單因子試驗設計進行，設立3個不同處理：0.1% HgCl2處理5 min，4% 84消毒液處理0 min、0.1% HgCl2處理5 min，4% 84消毒液處理3 min、0.1% HgCl2處理5 min，4%84消毒液處理6 min，最后用無菌水沖洗6次，置于無菌濾紙上切成帶頂芽或腋芽的1～3 cm小莖段，接種到誘導培養基上，每個培養瓶接種一個外植體。每個處理30個樣本，3次重復。后期觀察記錄試驗結果，統計外植體污染率、成活率和死亡率。

1.2.3 不同培養基下頂花板凳果組織培養情況測定 以MS為培養基，采用6-BA和NAA兩種植物生長激素不同濃度處理的雙因素試驗，共設置6組濃度處理：6-BA 1 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 2 mg/L+ NAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L + NAA 1 mg/L、6-BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L、6-BA 3 mg/L +NAA 1 mg/L，然后附加蔗糖30 g/L、瓊脂5.2 g/L，pH調至5.8左右，每個處理30個樣本，3次重復［16］。培養45 d，觀察記錄，統計愈傷組織及芽的誘導率及生長情況。

1.2.4 不同光照條件下頂花板凳果組織培養情況測定 接種后分別對培養基進行光照培養和暗培養。光照強度1 000 lx，光照時數14 h/d。暗培養采用報紙完全遮蓋培養基，避光培養。2種處理均為靜置培養，培養溫度為25（±2）℃。接種2周后，每7 d進行1次試驗觀察，詳細記錄愈傷組織和芽的誘導情況，包括發生時間、顏色、質地、生長情況等。

試驗數據用SPSS20.0統計軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同采樣時間對頂花板凳果組織培養的影響

由表1可知，頂花板凳果外植體不同采樣時間情況下，其組織培養的誘導率、污染率及愈傷組織和芽誘導情況均有較大差異（圖1～圖4，封二）。5月是頂花板凳果外植體采樣的最佳時期，誘導率最高、為44%，污染率最低、為11%，且愈傷組織和芽的生長狀況最好，萌動和分化最明顯；6月相對5月植物誘導率降低，污染率升高，分別為20%、35%；1月的誘導率最低、為10%，污染率最高、為84%；3月相對1月外植體誘導率增大、為37%，污染率相對降低、為33%。

表1 不同外植體采樣時間對頂花板凳果組織培養的影響

2.2 不同外植體消毒方式對頂花板凳果組織培養的影響

由表2可知，0.1% HgCl2消毒5 min后再用4%84消毒液分別消毒0、3、6 min，隨著4% 84消毒液處理時間的延長，污染率逐漸降低，死亡率逐升高，但是污染率下降不明顯，死亡率差異較大，分別增加29、25個百分點，說明4% 84消毒液處理可達到消毒的效果，但其毒害作用也比較強，對外植體產生較大影響。因此，只用0.1% HgCl2處理5 min，是較好的外植體消毒方式。

表2 不同外植體消毒方式對頂花板凳果組織培養的影響

2.3 不同激素配比頂花板凳果組織培養的影響

生長素和細胞分裂素協同調控作用在植物組織培養中起到重要作用。研究結果表明，6個不同激素濃度配比培養基的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導率分別為16.7%、11%、47%、33%、27%、26.7%。其中6-BA 2 mg/L + NAA 0.5 mg/L處理的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導率最高、為47%。6-BA 1 mg/L + NAA 1 mg/L處理的頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導率最低、為11%。當6-BA濃度保持不變時，愈傷組織和芽的誘導率隨著NAA濃度的下降而下降；當NAA濃度保持不變時，愈傷組織和芽的誘導率隨著6-BA濃度的增加呈先增加后下降的趨勢。

2.4 不同光照條件對頂花板凳果組織培養的影響

本研究結果表明，光照處理與黑暗處理對頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導有明顯差異。接種后直接進行光照培養，愈傷組織發生快，長勢好，大部分為嫩綠色，質地均勻蓬松，且出現較為明顯的芽的萌動和分化，誘導率高達60%。接種后直接進行暗培養則愈傷組織發生極慢，長勢差，大部分都褐化死亡，誘導率僅為4%，愈傷組織均為黃綠色，且沒有明顯的芽萌動和分化。

3 結論與討論

本研究結果表明，在植物組織培養中，不同培養條件對組織培養的影響有較大差異。不同采樣時間、外植體不同消毒方式、不同激素配比、是否光照處理等因素對頂花板凳果愈傷組織和芽誘導均有不同影響。這些差異會導致外植體生理生化狀態差異，從而影響組織培養的形態建成。5月采集的當年生健壯無病蟲害的幼嫩頂花板凳果帶芽莖段作為外植體，頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導情況最佳。此時，愈傷組織出愈快、長勢好、質地均勻，芽有明顯的萌動和分化。可能的原因是5月頂花板凳果春梢正處于大量萌發期，植物體內積累內源激素和營養物質較高，且植物體內的內部狀態良好，因此愈傷組織和芽的誘導率較高［17-18］。1月外植體正處于休眠期，組織老化，生命力弱，故污染率高，且其新陳代謝緩慢，內源激素和營養物質相對缺乏，故誘導率也低。3月與6月采集的外植體誘導率和污染率均處于中間水平，原因可能是3月氣溫逐漸回暖，植物體的休眠逐漸解除，生命活力也漸漸恢復，抗菌抗病能力增強，故誘導率升高、污染率下降。6月相對5月外界溫度升高和濕度均增大，微生物大量滋生，且頂花板凳果莖段更粗壯，表面積增大，導致在采樣和組培操作時材料更易被污染。

外植體消毒是組織培養過程的至關重要環節，為防止污染發生，從選材和接種前準備、接種及培養階段都投入了大量的人力、物力，既要保證外植體表面的微生物徹底被殺死，又要盡可能減少對外植體組織和表面細胞的傷害［19-20］。消毒藥劑濃度不能太低也不能太高，消毒時間不能太長或太短，若殺菌劑濃度過高或消毒時間過長，植物細胞會啟動自身的保護機智，不斷產生大量次生物質，引起細胞毒害，產生褐化甚至死亡，導致外植體的死亡率增加［21］。本試驗中，采用 0.1% HgCl2處理 5 min，而不用4% 84消毒液處理，就能達到較好的消毒效果，且死亡率相對較低。頂花板凳果外植體的消毒需要的時間較短，可能是材料在人工氣候培養室生長，采集的外植體均較幼嫩，減少了和外界復雜環境的接觸，所以攜帶的雜菌也較少。隨著用4% 84消毒液處理時間的加長，對外植體的毒害也相應加深，外植體的活性也隨之降低，導致死亡率增高。

在離體培養過程中，外源激素的種類、濃度及其組合配比誘導不同植物材料的不定芽效果不同［22］。NAA屬于天然生長素，合成比較穩定的化合物，能促進組培苗節間的伸長［23］；6-BA是第一個人工合成的細胞分裂素，在植物形態發育中能促進細胞分裂，利于愈傷組織的形態建成［24］，還能促進芽分化、側芽生長［25］。趙楊陽等［26］研究家獨行菜愈傷組織的叢生芽誘導時發現，6-BA作為主效植物生長調節物質，當濃度為1.5 mg/L時誘導率高達89.9%，效果較好。誘導器官發生時生長調節劑中細胞分裂素和生長素的配比至關重要，當外植體中生長素含量較高而細胞分裂素含量較低時，越有利于愈傷組織的誘導。吳秀燕等［27］研究發現，6-BA和NAA共同使用對美國流蘇莖段不定芽誘導效果較好，誘導率高達86.8%。本實驗培養基中加入激素6-BA濃度為2 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L時，頂花板凳果愈傷組織和芽的誘導率最高，且愈傷組織和芽均有明顯萌動，長勢旺盛，愈傷組織質地均勻，呈嫩綠色。這與程水金等［14］研究結果不一致，可能是材料的來源不同及個體差異導致。

光作為一種物理因子影響外植體的脫分化、器官的發生和幼苗的形態建成及生長發育過程。主要通過人工調控光強度、光質、光周期等光環境因子，且考慮光與其他環境因子共同作用，來滿足植物生長發育需要的光環境［28］。不同植物對光環境條件要求不一致，過高光強會抑制光合作用，導致光氧化，破壞光合作用器官；過低光強不利于植物的光合產物的積累和經濟產物的提高，因為弱光導致植物消耗更多自身結構物質來擴大光能接受面積及增加光系統組分的能量［29］。本研究中光照培養頂花板凳果的愈傷組織及芽的誘導率比暗培養高54%，說明頂花板凳果更適用于光照培養。

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