拮抗植物病原真菌Streptomyces corchorusii AUH-1的分離與鑒定

章帥文，楊 勇，劉 群，吳志明，李昆太

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

植物病害是造成農(nóng)作物生長(zhǎng)受阻、產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因植物病害而造成的農(nóng)業(yè)產(chǎn)量下降比例就高達(dá)10%～16%［1］。植物病原菌主要包括細(xì)菌、病毒、真菌、線蟲等，而約3/4的植物病害是由植物病原真菌引起的［2］。植物病原真菌常借助侵染墊、附著胞和吸器等侵染結(jié)構(gòu)完成對(duì)寄主的侵染，并在寄主組織中大量生長(zhǎng)，從而誘發(fā)植物真菌病害的發(fā)生［3-4］。例如，由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）引發(fā)的水稻稻瘟病以及紋枯病，已成為全球性的水稻主要病害［5-6］；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種最為常見(jiàn)的世界性的土傳病原真菌，可引起葫蘆科、香蕉、瓜類、豆科、茄類、棉花等100多種植物發(fā)生枯萎病［7-9］；此外，由炭疽病菌（Colletotrichum）引發(fā)的植物炭疽病，也是造成花果和蔬菜等植物重大損失的一類常見(jiàn)真菌病害［10］。

利用拮抗微生物或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行植物病害生防，具有環(huán)保、安全、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且很多拮抗微生物都具有對(duì)作物的促生作用，因此微生物生防顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景，成為目前研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）是鏈霉菌屬中的一種，對(duì)黃瓜枯萎病［11］、草莓枯萎病［12］、草莓炭疽病［13］等多種植物病害均具有一定的抑制作用。本研究以西瓜枯萎病菌為指示菌，從土壤中分離篩選到1株對(duì)植物病原真菌具有良好拮抗作用的黃麻鏈霉菌AUH-1，采用生理生化方法和16S rDNA序列分析對(duì)其鑒定，以期為該拮抗菌后期的活性物質(zhì)檢測(cè)與生物防治應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土樣：從江西南昌、贛州、鷹潭、萍鄉(xiāng)、福建武夷山、河北石家莊等地用五點(diǎn)取樣法采集不同類型土樣26個(gè)。

供試菌株：意大利青霉（Penicillium italicum）、西瓜枯萎病菌（Fusarrium oxysporum f.sp.niveum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基：高氏一號(hào)培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，硫化氫（H2S）產(chǎn)生培養(yǎng)基（柴斯鈉培養(yǎng)基），纖維素分解培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，淀粉水解測(cè)定培養(yǎng)基，牛奶液化測(cè)定培養(yǎng)基，硝酸鹽還原培養(yǎng)基［14-15］。

主要試劑：Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶；DNA marker，PCR通用引物等。

主要儀器：2720 Thermal cycler PCR儀，3730-XL測(cè)序儀，F(xiàn)R980凝膠成像系統(tǒng)，HC-2518R 冷凍高速離心機(jī)，DYY-5電泳儀，光學(xué)顯微鏡，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗放線菌菌株的分離篩選 放線菌菌株的分離：為了獲得豐富的放線菌資源，本研究從江西南昌、贛州、鷹潭、萍鄉(xiāng)、武夷、河北等地采集了26個(gè)不同類型的土樣。分別稱取10 g土樣加入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中制成10-1的土壤懸浮液，以無(wú)菌水梯度稀釋至10-3、10-4、10-5；吸取0.2 mL各梯度稀釋液，分別涂布在加有50 mg/L放線菌酮和50 mg/L重鉻酸鉀的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)7 d；挑取呈放線菌菌落特征的單菌落，轉(zhuǎn)接于高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)一步分離純化和保存。

放線菌菌株純化：挑取30℃培養(yǎng)7 d后呈放線菌菌落特征的單菌落，轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)一步分離純化，于20%甘油溶液中保存，-20℃存放備用。

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗菌的初篩［16］：將待測(cè)病原真菌菌餅菌（6 mm）面朝下接種至中心位置，用滅菌后的牙簽挑取相同大小的供試放線菌倒置接種于距中心30 mm處，每個(gè)處理3次重復(fù)，以只接植物病原真菌作為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照組植物病原真菌菌絲鋪滿整個(gè)平板時(shí)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的抑菌帶寬度（R2）和指示菌菌落直徑（R1），并根據(jù)（R1-R2）/R1的比值大小，篩選出抑菌活性強(qiáng)的放線菌菌株。

拮抗放線菌的復(fù)篩：采用管碟法（牛津杯）進(jìn)行拮抗放線菌的復(fù)篩。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液與冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合均勻，每100 mL培養(yǎng)基加入10 mL菌懸液，制成帶菌平板。類似地，釀酒酵母菌、西瓜枯萎病菌、枯草芽孢桿菌等以PDA培養(yǎng)基制成帶菌平板。等平板凝固后，在平板上放經(jīng)過(guò)滅菌的牛津杯，各取200 mL經(jīng)復(fù)篩培養(yǎng)基（可溶性淀粉20.0 g/L，KNO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.2～7.4）發(fā)酵的無(wú)菌發(fā)酵液吸入其中。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)2 d，真菌在30℃培養(yǎng)2～3 d。然后測(cè)定抑菌圈直徑，挑選出具廣譜抗菌特性的拮抗放線菌。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定 菌絲形態(tài)學(xué)觀察：采用平皿插片法，將拮抗菌株接種于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7～14 d，取插片在光學(xué)顯微鏡下觀察基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的形態(tài)。

生理生化特征：參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》［15］中的方法，進(jìn)行拮抗菌的碳源利用、明膠液化、纖維素分解、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、硝酸鹽還原、產(chǎn)H2S測(cè)定等試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，采用通用引物27F（5′-AGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增拮抗菌株的16SrDNA。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 45 s、55℃退火 45 s、72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。待PCR反應(yīng)完成后，取1μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。將測(cè)序得到的16SrDNA序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，用MEGA 4.1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定拮抗菌株的親緣關(guān)系和分類地位。

采用Excel 2003和DPS 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用Photoshop CS5進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離篩選

2.1.1 拮抗放線菌的初篩 以西瓜枯萎病病原菌為供試菌株，采用對(duì)峙法對(duì)26個(gè)不同類型的土樣中初篩得到15株對(duì)西瓜枯萎病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，由抑菌帶的大小和（R1-R2）/R1的比值大小可知，菌株AUH-1對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制能力最強(qiáng)，其抑菌帶寬度和（R1-R2）/R1比值分別達(dá)到29.46（±0.48）mm和36.15%，如圖1（封三）所示。

表1 拮抗放線菌的初篩結(jié)果

2.1.2 拮抗放線菌的復(fù)篩 采用管碟法測(cè)定拮抗菌株AUH-1對(duì)不同供試菌株的抑制效果，挖取2 cm×1 cm大小的菌塊接種至裝量為40 mL/250 mL三角瓶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L，玉米淀粉20 g/L，玉米漿20 g/L，黃豆餅粉 10 g/L，(NH4)SO41 g/L，KH2PO40.25 g/L，MnCl20.05 g/L，MgSO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH 7.2～7.4）中發(fā)酵，180 r/min、28℃下?lián)u床培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液無(wú)菌過(guò)濾，備用。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液與冷卻至50℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合均勻，每100 mL培養(yǎng)基加入10 mL菌懸液，制成帶菌平板。類似地，酵母菌、枯草芽孢桿菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉菌和水稻紋枯病菌等以PDA培養(yǎng)基制成帶菌平板。平板凝固后，在平板上放置經(jīng)過(guò)滅菌的牛津杯，各取200 μL無(wú)菌發(fā)酵液吸入其中。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)2 d，真菌在30℃培養(yǎng)2～3 d。然后用十字交叉法測(cè)抑菌圈直徑。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 菌株AUH-1的鑒定

2.2.1 菌株AUH-1的菌落特征 從圖2（封三）可以看出，菌株AUH-1的菌落正常、黃色、幾乎不產(chǎn)孢子，長(zhǎng)于基內(nèi)，具有明顯的放線菌菌落特征。為了進(jìn)一步鑒定該菌株的種屬情況，對(duì)其開展了菌體形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析。

表2 菌株AUH-1發(fā)酵液對(duì)供試菌株的抑制效果

2.2.2 菌株AUH-1的菌絲形態(tài)特征 菌株AUH-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察到的菌絲體形態(tài)如圖3（封三）所示。菌株AUH-1在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育良好，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲較為豐富，少量氣生菌絲分化形成孢子。

2.2.3 菌株AUH-1的生理生化特征 表3為菌株AUH-1的碳源利用情況和生理生化特征。從表3可以看出，菌株AUH-1可以利用D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、麥芽糖、肌醇、D-果糖、和淀粉，不能利用D-木糖、山梨醇、甘油和阿拉伯糖；菌株AUH-1不能水解淀粉和分解纖維素，能使明膠液化以及牛奶凝固與胨化，能產(chǎn)硫化氫和還原硝酸鹽。

表3 菌株AUH-1的生理生化特征

2.2.4 菌株AUH-1的分子生物學(xué)鑒定 菌株AUH-1的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到1條約為1.4 kb的特征帶，經(jīng)測(cè)序其16S rDNA的序列長(zhǎng)度為1 491 bp。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的16S rDNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建菌株AUH-1的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），分析結(jié)果顯示菌株AUH-1與Streptomyces corchorusii的系列同源性達(dá)到99%。

3 結(jié)論與討論

微生物防治主要是利用有益的微生物，通過(guò)生物堿間的競(jìng)爭(zhēng)、抗生、寄生、溶菌及誘導(dǎo)抗性等作用，抑制病原物的存活［17］。目前，用于植物病害生防的微生物種類繁多，主要有真菌、細(xì)菌和放線菌等［18］。例如，作為植物根際促生菌中最大的細(xì)菌種群，假單胞桿菌（Pseudomonas spp.），尤其是熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorscens），能有效地定殖在植物根際，控制植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，是植物病害生防研究中的一個(gè)重要類群［19］。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的AUH-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

放線菌是一類廣泛存在于土壤、植物體、淡水和海洋中的生防菌［20］，種類繁多，具有復(fù)雜的次級(jí)代謝系統(tǒng)，能產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是微生物農(nóng)藥的重要來(lái)源［21］，在植物病害防治中具有舉足輕重的作用［22］。目前從自然界中發(fā)現(xiàn)上萬(wàn)種天然抗生素中，近70%是由放線菌產(chǎn)生的，其中鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素占總數(shù)的52%［23-25］。鏈霉菌是放線菌門中種類最多的一個(gè)屬，是各種抗生素的主要產(chǎn)生來(lái)源［26-27］。鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)，能夠特異作用于某些病原菌，降低其生長(zhǎng)和繁殖速度，從而降低病害發(fā)作的頻率［28］。其中，由鏈霉菌產(chǎn)生的滅瘟素（Blasticidin S）、春日霉素（Kasugamycin）、多氧霉素（Polyoxins）、井岡霉素（Validamycin A）等，更是成功地商業(yè)化運(yùn)用于水稻、蔬菜和果類等的真菌病害防治中［29］。

本研究通過(guò)分離篩選得到1株拮抗鏈霉菌AUH-1，初步鑒定為黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）。黃麻鏈霉菌作為鏈霉菌屬的一員，然目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該菌的報(bào)道極少，特別是對(duì)其所產(chǎn)活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)及抑菌機(jī)理等方面的研究更是少之甚少。燕照玲等［11］在開展植物病原真菌拮抗菌的分離篩選過(guò)程中，也獲得了1株對(duì)黃瓜枯萎病菌具有高效拮抗作用的Streptomyces corchorusii，但未有關(guān)于其活性物質(zhì)方面的研究。根據(jù)國(guó)外現(xiàn)有研究表明，Streptomyces corchorusii系蒽醌類（anthraquinone）抗腫瘤抗生素的主要產(chǎn)生菌［30］，如拒霉素（resistomycin）和特曲霉素D（tetracenomycin D）［31］。值得注意的是，本研究是以植物病害生物防治為目的，分離篩選到1株植物病原真菌拮抗菌Streptomyces corchorusii AUH-1，該菌是否也會(huì)產(chǎn)生拒霉素和特曲霉素D等抗腫瘤抗生素，有待進(jìn)一步對(duì)其活性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。另外，盡管菌株AUH-1具備的廣譜性拮抗植物病原真菌特點(diǎn)為其在不同類型植物病害上的生防應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但其抑菌機(jī)理以及在田間的防病效果，有待進(jìn)一步研究。

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