一株小葉榕抗菌內生細菌的分離、篩選和鑒定

鄧雪萍，楊 博

（1.清遠職業技術學院食品藥品學院，廣東 清遠 511510；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

在健康植物組織內部通常生存著一些微生物，但不會導致宿主植物有明顯的感染癥狀，稱為植物內生菌［1］。有研究報道，植物的根、莖、葉、花、果實和種子經過表面消毒后，均能分離到內生菌。植物內生菌能產生種類多樣的活性成分，經證實，這些活性成分大多為抗腫瘤活性類［2-3］、抗菌類活性類［4-5］、抗糖尿病物質類［2］、活性酶類［6-7］、抗氧化活性類［8］、殺蟲活性類［9-10］、促植物生長類［11］等。因此，內生菌在生物防治、醫藥衛生等領域的應用潛力非常大，國內外對內生菌的相關研究也越來越多［10］。

小葉榕（Ficus microcarpa L.f.）是常綠小喬木，樹冠傘形或圓形，葉色深綠，入藥主要用其葉。小葉榕的葉片含有多種藥用成份，如黃酮、三萜類、齊墩果酸、脂肪族化合物和甾體化合物等，經證實，小葉榕水提取物和醇提取物有止咳平喘作用，對治療心血管疾病、抗炎、抑菌等方面都有顯著效果［12］。目前，還沒查詢到國內外對小葉榕內生菌的相關研究資料。本試驗從清遠職業技術學院校內種植的小葉榕中分離純化內生菌，并篩選抗菌活性菌株，鑒定到菌種，為尋找天然抗菌物質提供有用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物樣本：選取清遠職業技術學院校內種植的小葉榕的不同植株，采集健康的莖和葉片。

培養基：營養瓊脂（NA），營養肉湯（NB），高氏一號培養基，馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基，發酵培養基（1%葡萄糖、2%酵母粉、0.3% 磷酸氫二鉀、0.05%氯化鈉，pH 7.0）。

篩選指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger），均由清遠職業技術學院應用微生物研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 小葉榕內生菌的分離純化 用無菌剪刀剪取植株頂端健康的莖段和嫩葉，用干凈的保鮮袋裝好，立即進行下述處理（如不能立即處理，則將樣本置于4℃冰箱中1周內處理）：莖段和葉片均采用75%酒精-0.1%升汞法表面消毒，印跡法和最終洗滌水法相結合檢驗消毒效果。分離內生菌時，莖段采用組織塊法，葉片采用組織勻漿法［13］，具體操作見圖1～圖3，所有操作均為無菌操作。對照平板7 d內有菌生長或分離平板在7 d內無菌生長，均判定表面消毒無效；對照平板7 d內無菌生長且分離平板在7 d內有菌生長，則判定表面消毒有效。逐日觀察對照平板和分離平板，一旦發現培養基中有菌長出，及時分離純化到對應培養基，28（±1）℃（內生真菌）或36（±1）℃（內生細菌）培養3～7 d。重復以上步驟，直至分離到純培養物。

圖1 莖段內生菌分離步驟

圖2 葉片內生菌分離步驟

圖3 對照平板制備流程

1.2.2 抗菌活性內生菌的篩選 發酵濾液的制備：內生菌解凍復蘇后，取5環到5 mL無菌生理鹽水制備菌懸液，按1%的接種量接入發酵培養基，在34（±1）℃、160 r/min搖床中培養72 h。發酵液8 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm的無菌微孔濾膜過濾除菌后得發酵濾液，用作抑菌試驗［13-15］，3次重復（本試驗只對分離得到的兩株內生細菌進行抗菌活性篩選）。

杯碟法檢測發酵濾液抗細菌、抗酵母菌活性：將指示菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌接種于NA平板，36（±1）℃培養24 h；白色念珠菌接種于PDA平板，28（±1）℃培養48 h。選取單菌落混懸于滅菌生理鹽水，使指示菌液最終濁度與0.5號麥氏標準比濁管相同，此時菌懸液中菌數大概為1.5×108CFU/mL［13，16］。在平板上均勻涂布指示菌液，5 min后用無菌鑷子夾取無菌牛津杯放入平板上，每塊平板可放3～4個牛津杯，牛津杯之間的距離相等。牛津杯內加入200 μL發酵濾液，蓋上皿蓋，用無菌生理鹽水做對照。以上均在28（±1）℃暗處培養48 h，培養完畢，取出牛津杯，測量抑菌圈直徑。

菌落生長速率法檢測發酵濾液抗絲狀真菌活性：黑曲霉為指示菌，將1 mL發酵濾液加入到無菌培養皿中，倒入9 mL已冷卻至40℃左右的PDA培養基，充分搖勻，冷卻后，將直徑6 mm、28（±1）℃培養48 h的黑曲霉菌塊接種于該平板中央，蓋上皿蓋，以不加發酵濾液的10 mL PDA培養基作為對照，試驗平板和對照平板均在28（±1）℃暗處培養3～5 d，每天用游標卡尺測量菌落直徑，計算內生菌發酵濾液對黑曲霉菌絲生長的抑制率（%）［17-18］。

1.2.3 抗菌活性內生菌的鑒定 培養特征、菌體形態觀察及生理生化特性試驗：本試驗僅對分離得到的抗菌活性內生細菌QYPT-B01進行鑒定。將內生菌株接種到NA斜面、NA平板、NB肉湯，34（±1）℃培養2～5 d，觀察內生菌的培養特征，并進行革蘭氏染色、芽孢染色和生化反應，按《常見細菌系統鑒定手冊》［19］中的方法進行操作和鑒定：抑菌圈直徑0～5 mm 表示無抑制作用，6～15 mm 表示弱抑制作用，＞15 mm 表示強抑制作用。

16S rDNA基因序列測定：將內生細菌菌株接種到營養肉湯，34（±1）℃下160 r/min培養至對數生長期后，12 000 r/min離心5 min，在菌體沉淀中加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）800 μL和32 μL溶菌酶，使溶菌酶最終濃度為2～4 mg/mL，振蕩均勻；37（±1）℃保溫30～60 min至菌液呈牛乳狀；加入65 μL 25%SDS，顛倒混勻，50～60℃水浴10 min至溶液完全清亮；加入200～400 μL氯仿-異戊醇（24∶1）溶液，充分振蕩混勻，冰上放置10 min；12 000 r/min條件下離心10 min后，取上清液；加入0.7～1倍體積異丙醇，顛倒混勻，將白色絮狀沉淀挑出至70%乙醇中洗滌兩次，吹干，溶于適量的超純水中，振蕩溶解，置于－20℃冰箱中。按上述方法提取基因組DNA后，以其為模板，設計引物為 P16sF1：5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAGAACGAACGCT-3′；P16sB1：5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTCACCCC-3′。PCR 的程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；48℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個循環后72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切割目標條帶，使用Roche Applied Science試劑盒純化電泳產物。PCR反應擴增出的16S rDNA片段經純化后，委托上海生工生物工程技術服務公司測序。利用NCBI網站中的Blast工具（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），將QYPT-B01菌株的16S rDNA序列與Genbank中已知細菌的16S rDNA序列進行比較，尋找與目的基因序列同源性最高的己知分類地位的菌種，并得到同源性相似百分比。Matsulci［20］研究認為，凡是16S rDNA可變區序列同源性大于97.5%便可認為是同一個種，所以本試驗以同源性大于97.5%為菌種的鑒定標準，進一步利用MGTA7.0.26軟件構建系統發育樹，確定該菌的分類地位。

2 結果與分析

2.1 小葉榕內生菌分離純化結果

從小葉榕植物樣本中分離得到7株絲狀真菌和2株細菌。將分離得到的9株內生菌進行體外培養，發現有一株絲狀真菌不能生長（表1）。

表1 小葉榕內生菌的分離純化結果

2.2 抗菌活性內生菌篩選結果

分離得到的一株小葉榕內生細菌（命名為QYPT-B01）發酵濾液對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌和大腸埃希菌有較強的抑制作用（圖4，封三；表2），其中對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑達23.28（±0.286）mm，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有較弱的抑制作用，而對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。QYPT-B01菌株發酵濾液對白色念珠菌沒有抑制作用，對黑曲霉的生長有很強的抑制作用（圖5，封三；表3），培養3 d后該菌株發酵濾液對黑曲霉菌絲生長的抑制率達77.25（±0.212）%，培養5 d后抑菌率達82.39（±0.140）%。在培養過程中，對照平板黑曲霉菌落厚、菌絲多且強壯、形成大量黑色孢子，而試驗平板菌落薄、菌絲少且纖細、沒有孢子形成，培養4 d后菌落大小不再有變化。試驗分離到的另一株內生細菌對5種指示菌均無抑制作用。

表2 QYPT-B01菌株發酵濾液對4種指示菌的抑菌效果

表3 QYPT-B01菌株發酵濾液對黑曲霉菌絲生長的抑制效果

2.3 抗菌活性內生菌鑒定結果

2.3.1 培養特征、菌體形態觀察及生理生化特性試驗結果 QYPT-B01菌株在34（±1）℃培養箱中培養3 d后，在NA斜面上其菌苔呈灰白色，邊緣不規則，向四周擴展，表面有皺褶、干燥、不透明；在NA平板上其菌落灰白色，較大，扁平，邊緣不規則，菌落向四周擴展明顯，呈樹根狀，表面有皺褶、干燥、不透明；在NB肉湯液面形成一層灰白色的菌膜，培養液仍澄清。革蘭氏染色呈陽性，顯微鏡下觀察呈直桿狀，芽孢近中生，孢子囊不膨大。菌株的主要生理生化特征見表4。結合培養特征、形態觀察和生理生化特性，初步鑒定QYPT-B01菌株為芽孢桿菌屬。

2.3.2 16S rDNA測序結果 QYPT0-B1菌株的16S rDNA經PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物分析，結果見圖6。從圖6可以看出，QYPT-B01菌株的16S rDNA擴增片斷長約1.5 kb，細菌16S rDNA的長度一般為1.550（±0.200）kp。將PCR產物測序，得到全長為1.426 kp的16S rDNA序列。該序列與GenBank中的細菌16S rDNA序列比較，獲得同源序列為芽孢桿菌屬（Bacillus）的16S rDNA序列，其相似性達到98%。QYPT-B01菌株的16S rDNA序列與66株枯草芽孢桿菌16S rDNA序列的相似性也達98%（表5）。基于QYPT-B01菌株和芽孢桿菌屬的10個模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining方法構建系統發育樹，1 000次隨機抽樣，計算自引導值（Bootstrap）以評估系統進化樹的置信度。從建立的系統發育樹（圖7）可以看出，QYPTB01和枯草芽孢桿菌的進化距離最靠近。結合培養特征、形態觀察和生理生化特性，最終鑒定內生細菌QYPT-B01為枯草芽孢桿菌。

表4 內生細菌QYPT-B01菌株與枯草芽孢桿菌主要生理生化特征比較

圖6 QYPT-B01菌株16S rDNA的PCR擴增結果

3 結論與討論

從小葉榕植物樣本中分離得到7株絲狀真菌和2株細菌，將分離得到的9株內生菌進行體外培養，發現有一株絲狀真菌不能生長。可能是由于某些內生菌的生長需要依賴宿主植物提供的環境條件，所以在普通培養基上難以生長，需進一步研究適合其生長的植物體外培養條件。

對分離得到的兩株內生細菌進行初篩，發現QYPT-B01菌株發酵培養72 h，其發酵濾液對銅綠假單胞菌和大腸埃希菌有較強的抑制作用，抑菌試驗平板培養48 h，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑達23.28（±0.286）mm，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱。QYPT-B01菌株發酵濾液對黑曲霉菌絲的生長有很強的抑制作用，試驗平板培養5 d后抑菌率達82.39（±0.140）%。綜上所述，小葉榕QYPT-B01菌株能產生主要針對革蘭氏陰性菌和絲狀真菌的抗菌活性物質，具有潛在的應用價值。對抗菌能力較強的內生細菌QYPT-B01菌株進行了培養特征和菌體形態觀察、生理生化特性試驗、16S rDNA基因序列測定和系統發育樹的構建，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表5 QYPT-B01菌株與6株枯草芽孢桿菌的16S rRNA基因同源性比較

圖7 QYPT-B01菌株在Bacillus屬中的系統發育地位

小葉榕由于易生長，遮陰效果好，所以分布十分廣泛，也是街道、公園、綠地、公路、企事業單位常用的園林景觀植物。但是受氣候、栽培因素等影響，小葉榕極易發生病蟲害，如槐尺蛾、刺蛾、灰白蠶蛾、榕木虱、榕管薊馬、葉斑病、煤污病、炭疽病等［21］。傳統的治療方法有合理密植、科學修剪、化學藥劑噴注和生物防治等方法，目前主要是用化學藥劑噴霧法［22］。從保護生態環境和可持續發展的角度看，生物防治是最好的防治方法，對人、畜、植物均安全，主要包括保護有益天敵和使用生物農藥兩種措施。小葉榕內生菌QYPT-B01是枯草芽孢桿菌，具有防治植物病害的作用，國內外已經成功研制出一批枯草芽孢桿菌菌劑［23-24］。國內已開發并投入生產的枯草芽孢桿菌商品制劑有麥豐寧、百抗、紋曲寧、依天得、亞寶等。QYPT-B01內生菌能產生抑菌活性物質，今后可進一步研究該活性代謝產物對植物病原菌的拮抗作用，以開發具生防作用的微生物菌劑。植物與動物和人類一樣，均屬于真核系統，而內生菌能寄生在植物體內，說明內生菌產生的活性物質毒性較低或無毒，否則宿主組織會受損傷甚至死亡，可見，植物本身已對活性成分進行了初篩，利用QYPT-B01內生菌作為生防菌劑的來源優勢明顯，具有良好的應用前景。

綜上可知，今后可進一步研究QYPT-B01菌株發酵液中活性物質的組分及其對植物病原菌的拮抗作用，以進一步開發生物防治菌劑。

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