蠐螬抗菌肽的制備及其穩(wěn)定性研究

王 成，余以剛，張 青，余祥雄，梁澤明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

近年來，由于濫用抗生素飼料添加劑導(dǎo)致的抗藥性和藥物殘留問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類健康，尋找一類新型的抗菌藥物是解決該問題的有效途徑。昆蟲抗菌肽是昆蟲免疫后血淋巴中的一類抗菌多肽，它具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣的特點(diǎn)，可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲，且抗菌機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生抗藥性［1］。研究表明，抗菌肽具有作為一類新藥開發(fā)的巨大潛力，但由于抗菌肽的蛋白性質(zhì)，很多種類的抗菌肽穩(wěn)定性特別是酶解穩(wěn)定性差，制備出穩(wěn)定性好的抗菌肽具有重要的實(shí)際意義。

抗菌肽又稱抗微生物肽，是生物體液免疫的重要防御因子，在昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，抗菌肽主要由脂肪體（類似于哺乳動(dòng)物的肝臟）分泌，其他組織如消化道、氣管、馬氏管和特定的血細(xì)胞也能夠產(chǎn)生［2］。當(dāng)昆蟲體壁受到損傷或被微生物感染后，抗菌肽被迅速合成，并釋放入血淋巴中作用于細(xì)菌、病毒、真菌等［3］。其活性維持時(shí)間因昆蟲種類不同存在明顯差異［4］。

蠐螬隸屬于鞘翅目（Coleoptera），是金龜甲總科（Scarabaeoedea）幼蟲的統(tǒng)稱，又名地蠶、土蠶［5］。借助現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)以及檢測(cè)手段分析得知，蠐螬體內(nèi)含有各種氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)、糖類、生物堿和羧酸類化合物，以及較高含量的鈣、鐵、銅、錳等礦物元素［6］。近年來的研究表明，蠐螬具有顯著的抗癌抑癌、抗腫瘤［7］、抗氧化［8］、抗衰老和抗病毒、抗菌功效［9］。本研究使用酶解法以加酶量、酶解時(shí)間、料液比、pH為因素優(yōu)化胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白制備蠐螬抗菌肽的制備工藝，并研究pH、溫度、鹽濃度等環(huán)境因素對(duì)蠐螬抗菌肽抗菌效果的影響，為蠐螬資源的深度加工利用和自然抗菌產(chǎn)物研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、角蛋白酶（諾維信公司），脫脂蠐螬（廣東漢肽生物工程有限公司），大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（廣州市菌種保藏中心）。

模擬胃液的配制：取胃蛋白酶3.20 g，NaCl 2.00 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，HCl調(diào)節(jié)pH值至1.20。

模擬腸液的配制：取胰蛋白酶10.00 g，磷酸二氫鉀6.80 g，溶解于1.00 L蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.50。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堿溶酸提法提取蠐螬蛋白 準(zhǔn)確稱取50.00 g脫脂蠐螬樣品，以1∶15（ g/mL）的比例加入750 mL 1.5%的NaOH溶液，于60℃恒溫水浴鍋中攪拌1 h，1 000 r/min下離心10 min，取上清液。往上清液中緩慢倒入8.00 mol/L的HCl，直至不再產(chǎn)生沉淀，1 000 r/min離心力下離心10 min，取沉淀，冷凍干燥待用［10］。

1.2.2 酶解法制備蠐螬抗菌肽 準(zhǔn)確稱取5.00 g蠐螬蛋白樣品，按1∶15（ g/mL）比例加入75.00 mL蒸餾水，用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl將樣品調(diào)整到最適pH，按照50.00 ku/g酶活加入蛋白酶，酶解過程中用0.20 mol/L NaOH和0.20 mol/L HCl維持pH。酶解完成后，95℃中水浴15 min，終止酶解反應(yīng)，5 000 r/min離心5 min，取上清液，得到蠐螬酶解液。

1.2.3 牛津杯法測(cè)抑菌活性 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定蠐螬酶解樣品抑菌活性［11］。使用LA復(fù)活菌株，LB培養(yǎng)，增值菌株。測(cè)定時(shí)，使用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至1.00×106CFU/mL。牛津杯直徑為6.00 mm，上樣量為150 μL。抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好［12］。

1.2.4 水解度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中水解度的測(cè)定按照 pH-stat法測(cè)定［13］。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以抑菌效果（抑菌圈直徑）為指標(biāo)，在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，研究以下4個(gè)因素對(duì)抗菌肽抑菌效果的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

加酶量的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 ku/g添加胰蛋白酶，酶解時(shí)間為60 min，料液比為1∶20（g/mL），pH為8.00的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶用量。

酶解時(shí)間的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比為1∶20（ g/mL），pH為8的條件下進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min。酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶解時(shí)間。

料液比的選擇：準(zhǔn)確稱取5份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（ g/mL），酶解時(shí)間為90 min，pH為8的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳料液比。

pH的選擇：準(zhǔn)確稱取4份脫脂疥蟲樣品各1.00 g置于50 mL錐形瓶中，以加酶量為40.00 ku/g，酶解時(shí)間為90 min，料液比為1∶20（ g/mL），pH分別為6.50、7.00、7.50、8.00、8.50的條件下進(jìn)行酶解，酶解過程中用0.10 mol/L的NaOH使pH恒定，記錄NaOH使用量，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，選擇最佳酶解pH。

1.2.6 正交法優(yōu)化胰蛋白酶制備抗菌肽條件 在酶解溫度（37℃）恒定的條件下，以加酶量、酶解時(shí)間、料液比和酶解pH為因素，分別設(shè)置4個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)［14-15］，優(yōu)化蠐螬抗菌肽制備條件（表1）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)各因素及水平

1.2.7 蠐螬抗菌肽穩(wěn)定性研究 （1）蠐螬抗菌肽酸堿度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.0 mL，用0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl 配制一系列pH值為 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00的溶液，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組為一系列不同pH值的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（2）蠐螬抗菌肽的溫度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物 1.00 mL，分別在 20、30、40、60、80、100℃條件下放置30 min，處理完成后放置至室溫，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照樣品為無菌蒸餾水。

（3）蠐螬抗菌肽鹽濃度穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.00 mL，用NaCl 配制一系列鹽濃度為 0、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00、120.00、140.00、160.00、180.00、200.00 mmol/L的溶液，取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。對(duì)照樣品為一系列不同鹽濃度的溶液（不加抗菌肽樣品）。

（4）蠐螬抗菌肽水解穩(wěn)定性研究。各取酶解產(chǎn)物1.00 mL，根據(jù)上述配制方法比例配制模擬胃液和模擬腸液，分別在37℃中水浴處理30 min，以未處理的抗菌肽溶液和不添加胃/胰蛋白酶的人工胃/胰液為對(duì)照。取100.00 μL樣品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖1 加酶量對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖1所示，當(dāng)加酶量在20.00～40.00 ku/g范圍增加時(shí)，蠐螬蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均增強(qiáng)，而當(dāng)加酶量大于40.00 ku/g時(shí)，酶解產(chǎn)物的抑菌效果變?nèi)酰患用噶看笥?0.00 ku/g時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌幾乎沒有抑制效果。產(chǎn)生這種效果的可能原因是：加酶量增大時(shí)，胰蛋白酶對(duì)蠐螬蛋白的水解程度增強(qiáng)，將具有抗菌活性的多肽水解為分子量更小的多肽，從而使抗菌肽失去了抗菌活性［16］。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

如圖2所示，當(dāng)酶解時(shí)間在30～90 min時(shí)，蠐螬酶解產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑制效果隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間超過90 min時(shí)，酶解產(chǎn)物的抑菌效果明顯降低。實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，酶解時(shí)間為90 min時(shí)，酶解產(chǎn)物的抑制效果最好。這是由于長(zhǎng)時(shí)間的酶解會(huì)將抗菌肽酶解為更小的分子，這些小分子肽是不具有抑菌活性的，因此酶解物的抑菌活性會(huì)在90 min以后開始下降。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.3 料液比對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)條件內(nèi)，酶解產(chǎn)物的抑菌效果隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20 （g/mL）時(shí)，胰蛋白酶水解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

2.4 pH對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)選取的pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH小于8.00時(shí)，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌效果隨著pH的增大而增加，但當(dāng)pH為7.50和8.00時(shí)，酶解產(chǎn)物的抑制效果沒有明顯改變，當(dāng)pH大于8.00時(shí)，酶解產(chǎn)物的抑菌效果明顯下降，因此pH8.00為制備蠐螬抗菌肽的最佳pH值。

圖3 料液比對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

圖4 pH對(duì)蠐螬酶解物抑菌效果的影響

2.5 胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白條件優(yōu)化

從表2可以看出，當(dāng)蠐螬蛋白酶解度為15.21%、15.61%和16.03%時(shí)，酶解液對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌的抑制效果差別不大，分別為9 mm和11 mm左右。當(dāng)酶解度較低如10.11%時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抑制效果不佳，可能是由于酶解程度不夠；當(dāng)酶解程度較高如20.01%時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抑制效果也不是最好，可能是由于酶解程度過高，抗菌肽片段太短造成的。通過極差分析可知，各因素對(duì)蠐螬蛋白酶解度的影響效果不一樣，各因素的顯著性依次為加酶量（A）>酶解時(shí)間（B）>pH（D）>料液比（C），胰蛋白酶酶解蠐螬蛋白實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)因素影響金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果的主次順序?yàn)椋杭用噶浚ˋ）＞酶解時(shí)間（B）＞料液比（C）＞ pH（D）。

表2 胰蛋白酶作用效果正交試驗(yàn)L16

對(duì)大腸桿菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優(yōu)水平組合為A2B1C2D3和A2B3C4D1即當(dāng)加酶量為40.00 ku/g、酶解時(shí)間為30 min、料液比為1∶15 （g/mL）、pH為8.00時(shí)，以及當(dāng)加酶量為40.00 ku/g、酶解時(shí)間為90 min、料液比為1∶25、pH為7.00時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好，兩種酶解條件下，得到的酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大，為9.00 mm（牛津杯直徑為6.00 mm），這種條件下獲得的酶解產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為10.50、10.60 mm。

對(duì)金黃色葡萄球菌而言，胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的最優(yōu)水平組合為A3B3C1D2，即當(dāng)加酶量為50.00 ku/g、酶解時(shí)間為90 min、料液比為1∶10 （g/mL）、pH為7.50時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為11.50 mm，而酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.70 mm。這與Tsukiyama等［17］的研究結(jié)果基本一致，其原因可能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)［18-19］。

為了制備具有更好抑制效果的蠐螬抗菌肽，將酶解脫脂蠐螬蛋白制備抗菌肽的各因素最優(yōu)水平組合確定為A3B3C1D2，即以加酶量為50.00 ku/g、酶解時(shí)間為90 min、料液比為1∶10（g/mL）、pH為7.50的條件酶解制備蠐螬抗菌肽。此時(shí)制備的酶解產(chǎn)物對(duì)E.coli和S.A的抑菌圈直徑分別為8.70、11.50 mm。

2.6 蠐螬抗菌肽的環(huán)境穩(wěn)定性

從圖5可以看出，蠐螬抗菌肽在pH為6.00的環(huán)境下，抑菌活性最好，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈為11.80 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為9.00 mm。當(dāng)pH增加到8時(shí)，抗菌肽的抑菌活性急劇下降。這與抗菌肽的蛋白特性有關(guān)，只有當(dāng)pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，抗菌肽分子的凈電荷才為正；而當(dāng)pH大于等電點(diǎn)時(shí)，抗菌肽分子凈電荷為零甚至為負(fù)，起不到抗菌的作用。

圖5 不同pH下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

圖6表示的是蠐螬抗菌肽經(jīng)過不同溫度處理30 min后，抑菌活性隨溫度的變化情況，由于在不同的pH值條件下，蠐螬抗菌肽的抑菌活性會(huì)隨pH值的改變而改變，故在溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)時(shí)將pH調(diào)整到6.00。蠐螬抗菌肽在低于100℃的溫度處理下，仍然保持原有的抗菌活性，而當(dāng)處理溫度超過100℃時(shí)，抗菌肽的抑菌活性開始出現(xiàn)明顯下降。表明蠐螬抗菌肽能在高溫下保持抑菌活性，具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖6 不同溫度下蠐螬抗菌肽的抑菌活性

據(jù)報(bào)道，環(huán)境中的鹽濃度對(duì)抗菌肽的抗菌活性也有很大影響。從圖7可以看出，對(duì)于不同的細(xì)菌，鹽濃度對(duì)抗菌肽的抑菌活性影響不同。對(duì)金黃色葡萄球菌而言，當(dāng)鹽濃度超過140.00 mmol/L，抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯減弱，而且隨著鹽濃度的升高，抑制活性降低；當(dāng)鹽濃度大于80.00 mmol/L時(shí)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑制活性隨著鹽濃度的增加而明顯減弱，當(dāng)鹽濃度大于180.00 mmol/L時(shí)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌基本沒有抑制效果。

圖7 鹽濃度對(duì)蠐螬抗菌肽抑菌活性的影響

由于抗菌肽的蛋白特性，實(shí)驗(yàn)研究了蠐螬抗菌肽的耐胃蛋白酶和耐胰蛋白酶水解情況?？瞻讓?duì)照表示的是蠐螬抗菌肽在水溶液中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。由圖8可知，蠐螬抗菌肽在不含胃蛋白酶的模擬胃液中，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的生長(zhǎng)抑制效果有所減弱，而在不加胰蛋白酶的模擬腸液中，抗菌肽對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的生長(zhǎng)抑制效果不變。這是由于模擬胃/腸液中各因素綜合影響的結(jié)果?？咕慕?jīng)過胃蛋白酶處理之后，其對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑制效果完全消失；但經(jīng)過胰蛋白酶處理之后的抗菌肽對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的生長(zhǎng)抑制效果略微減弱。表明蠐螬抗菌肽沒有抗胃蛋白酶水解的能力，但有較強(qiáng)的抗胰蛋白酶水解能力。

圖8 蠐螬抗菌肽的水解穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

本研究通過酶解法制備出對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抗菌效果的蠐螬抗菌肽，優(yōu)化了胰蛋白酶酶解制備抗菌肽的酶解條件，并研究了蠐螬抗菌肽的穩(wěn)定性，得出以下結(jié)論：

胰蛋白酶制備蠐螬抗菌肽的最適條件是加酶量為50.00 ku/g，酶解時(shí)間為90 min，料液比為1∶10 （g/mL），酶解pH為7.50。此時(shí)，蠐螬蛋白的水解度為15.21%，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制直徑分別為11.50 mm和8.70 mm。蠐螬抗菌肽的酸穩(wěn)定性比較好，但是不具有堿穩(wěn)定性，最佳pH為6.00；蠐螬抗菌肽具有較好的耐熱穩(wěn)定性；鹽濃度對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)菌，影響不同，對(duì)大腸桿菌而言，當(dāng)溶液中的鹽濃度大于80.00 mmol/L時(shí)，抗菌肽的抑制效果逐漸減弱；對(duì)金黃色葡萄球菌而言，當(dāng)溶液中鹽濃度大于180.00 mmol/L時(shí)，抗菌肽的抑制效果才開始出現(xiàn)明顯下降。蠐螬抗菌肽具有良好的耐胰蛋白酶水解穩(wěn)定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩(wěn)定性。

在本研究中，用胰蛋白酶制備得到蠐螬抗菌肽，實(shí)現(xiàn)了昆蟲資源的有效利用，但制備的蠐螬抗菌肽還只是初步的酶解混合物，抑菌效果還沒有達(dá)到抗生素的效果，后續(xù)工作將對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，以提高抗菌效果；另外，制備的抗菌肽雖然有良好的耐胰蛋白酶水解穩(wěn)定性，但不具有耐胃蛋白酶水解穩(wěn)定性，因此下一步工作將對(duì)抗菌肽進(jìn)行改性或者制成納米粒子以提高抗菌肽的穩(wěn)定性。

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