凍融囊胚移植結局的影響因素分析

邱乒乒，王燁，紀紅，沙艷偉，何雪梅，李萍

(廈門市婦幼保健院，廈門 361003)

在輔助生殖領域，囊胚移植與卵裂胚相比顯示出更為明顯的優勢：①有利于挑選發育潛能更大的胚胎；②具有更高的種植率；③有效降低移植胚胎數；④胚胎與子宮內膜的同步性更佳[1]。近年來隨著囊胚培養液體系的逐步改善及囊胚凍融技術的日益成熟，囊胚培養與移植在輔助生殖領域得到越來越廣泛的應用。較多研究證實復蘇周期囊胚移植的臨床妊娠率、種植率均顯著優于新鮮周期[2-3]。由于凍融D3胚胎后行囊胚培養可能導致取消移植周期的增多，加重患者的經濟和心理負擔，加之目前囊胚凍融后的復蘇存活率已與卵裂期胚胎無異，因此大部分生殖中心多在新鮮周期行囊胚培養，將可用囊胚進行冷凍后再行凍融囊胚移植。本研究回顧性分析我院2016年1～12月復蘇周期中380例囊胚移植的臨床數據資料，比較囊胚發育天數、囊胚質量、移植囊胚數等因素對臨床妊娠結局的影響，以優化復蘇周期的囊胚移植策略，為復蘇周期行選擇性單囊胚移植提供依據。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年1～12月在廈門市婦幼保健院生殖醫學科行凍融囊胚移植的患者資料。

納入標準：新鮮周期不孕原因為輸卵管因素、子宮內膜異位癥(EM)及子宮腺肌癥(AM)、男方因素。

排除標準：在一個復蘇周期中同時移植D5和D6囊胚的患者以及移植D7囊胚的患者。

按照以上標準共納入 357 例患者，共380個凍融囊胚移植周期。根據妊娠結局將患者分為2組：臨床妊娠組(259周期)；未臨床妊娠組(121周期)。

二、方法

1.囊胚培養及評分：本研究納入的357例患者在新鮮周期中所采用的促排卵方案按照本中心的常規進行，獲卵后行IVF或ICSI授精。胚胎培養采用Vitrolife(瑞典)序貫培養液。培養環境為37℃、6% CO2、5% O2和89% N2。受精后第3日挑選2個優質胚胎進行移植或冷凍，剩余胚胎轉移至囊胚培養液中繼續培養。D5和D6分別觀察囊胚形成情況。

囊胚評分參考Gardner評分系統[4]。根據囊腔的擴張程度對囊胚進行分期，共分為1～6期。對3～6期的囊胚行進一步的評價。

內細胞團(inner cell mass，ICM)評分：A，細胞數目多，排列緊密，碎片少；B，細胞數目較少，結合較松散；C，細胞數目極少，難以辨認。

外滋養層(TE)評分：A，細胞數量>10，大小均勻；B，細胞數量≈10，大小不均；C，細胞數量<10，大小不均，存在碎片。

本實驗室將ICM與TE的評分為AA、BA、AB、BB的囊胚定義為優質囊胚。

考慮到早期囊胚的復蘇率不佳，本實驗室將發育到3期以上的囊胚進行冷凍保存。冷凍囊胚標準為：3期以上且內細胞團評級在B級以上的囊胚。

2.囊胚冷凍及復蘇：本實驗室采用玻璃化冷凍方法進行囊胚冷凍。囊胚冷凍之前使用激光打孔的方法進行人工皺縮，其后的冷凍及復蘇操作均按照Origio(丹麥)玻璃化冷凍、解凍試劑盒說明書進行。解凍后的囊胚培養3～8 h后進行移植，解凍后2 h依據囊胚腔是否重新擴張來判斷囊胚是否存活。

3. 子宮內膜的準備與囊胚移植：⑴人工周期：D2～D3開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4 mg/d，每隔5～7 d監測一次內膜，每次以2 mg遞增，當內膜≥7 mm(服用補佳樂至少14 d后)口服黃體酮(安琪坦，博賞，法國)(300 mg，2次/d)，黃體酮轉化6 d后凍胚移植。⑵降調人工周期：D1～D2采用B超檢查子宮、卵巢、AFC數目及大小等盆腔情況，注射長效GnRH-a 3.75 mg，28～35 d后開始口服補佳樂(2 mg，2次/d)，每隔5～7 d監測一次內膜，每次以2 mg遞增，當內膜≥7 mm(服用補佳樂至少14 d后)口服黃體酮(300 mg，2次/d)，黃體酮轉化6 d后凍胚移植。

移植后使用黃體酮凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d陰道給藥行黃體支持，至移植后10 d測血β-HCG。

4.移植后結局判定：胚胎移植后4～6周，B超探及妊娠囊，確診為臨床妊娠；B超未探及妊娠囊判定為未臨床妊娠。擬診異位妊娠或宮內合并宮外妊娠者，積極觀察，一經確診盡早留院處理。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植囊胚周期數×100%。

三、統計學方法

結 果

一、患者基礎情況比較

2016年1～12月本院進行囊胚復蘇的共380個周期。根據妊娠結局將患者分臨床妊娠組和未臨床妊娠組，兩組患者的年齡、BMI、AMH、內膜厚度、不孕原因構成比均無統計學差異(P>0.05)；與妊娠組比較，未妊娠組患者不孕年限顯著增長(P<0.05)(表1)。

二、兩組患者的臨床治療及移植情況

統計結果顯示，兩組患者的治療方式無顯著性差異(P>0.05)；與妊娠組比較，未妊娠組患者平均移植胚胎數顯著減少(P<0.01)；妊娠組中D5囊胚所占的比例顯著高于未妊娠組(P<0.01)；妊娠組中雙優胚所占的比例顯著升高(P<0.01)，非優胚所占的比例顯著降低(P<0.01)；妊娠組中優質囊胚(雙優囊胚數與單優囊胚數之和)所占的比例顯著高于未妊娠組(P<0.01)(表2)。

三、Logistic回歸分析

從上述未經其他因素校正的統計數據得出，囊胚質量和囊胚發育速度與臨床妊娠率有關，因此在單因素分析中可將囊胚質量及囊胚發育天數作為預測臨床妊娠的兩個獨立指標。為了進一步綜合分析各因素對妊娠結局的影響，將是否臨床妊娠作為因變量，女方年齡、不孕年限、囊胚發育天數、移植優質囊胚數作為自變量進行Logistic回歸分析。

分析結果顯示，≥39歲患者的妊娠率顯著低于<35歲組[OR0.339，95%CI(0.130，0.886)；P=0.027)；雙優胚和單優胚移植組間的妊娠率無統計學差異[OR0.579，95%CI(0.290，1.156)；P=0.121)，而非優胚移植組的妊娠率相較雙優胚移植組顯著下降[OR0.362，95%CI(0.174，0.753；P=0.007)；在校正了以上各因素后，D5和D6囊胚的臨床妊娠率差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

討 論

隨著囊胚玻璃化冷凍技術的日趨成熟，與新鮮周期相比，復蘇周期囊胚移植更具優勢?？赡茉蚴悄遗邇鋈诒旧硪矘嫵蓪δ遗叩囊环N篩選，發育潛能較低或質量較差的囊胚在凍融之后不能實現再次擴張[5-6]，而在進行復蘇周期移植時棄用了這部分囊胚。在新鮮周期中D5形成囊胚的種植率和妊娠率明顯高于D6形成的囊胚，其原因可能是受到了內膜容受性的影響[7-10]。而復蘇周期中的內膜因素得以更好的控制，更能客觀地對各影響因素進行分析，因此本文選取復蘇周期中的囊胚移植為研究對象，通過單因素分析及多元Logistic回歸比較了囊胚發育天數、囊胚質量、移植胚胎數等因素對妊娠結局不同的影響。

表1 兩組患者基本資料[(-±s)，n(%)]

注：與妊娠組相比，*P<0.05

表2 兩組患者的移植情況[(-±s)，n(%)]

注：與未妊娠組比較，*P<0.01

表3 Logistic回歸Enter法

目前關于囊胚發育天數是否會對妊娠率和種植率產生影響，文獻報道的結果并不一致。有學者發現現D5和D6囊胚的整倍體率并無統計學差異[11]。一項納入15篇復蘇周期囊胚移植文章的Meta分析，統計了2 502個凍融囊胚移植周期，發現D5組囊胚移植后的臨床妊娠率、繼續妊娠率和活產率明顯高于D6組，但是精確比較D5和D6發育到同一階段的囊胚移植結局時并無統計學差異[12]。在本研究中，進行囊胚發育天數的單因素分析時，D5囊胚的臨床妊娠率顯著高于D6囊胚。然而隨后進行的多元Logistic回歸分析顯示囊胚發育天數的差異對妊娠結局無顯著的影響，臨床妊娠率與移植優質胚胎數的相關性最大。D5的平均移植囊胚數為(1.75±0.43)枚，D6的平均移植囊胚數為(1.66±0.48)枚(P=0.11)，二者無統計學差異。因此本研究數據表明，囊胚質量對妊娠結局的影響大于囊胚發育速度。Yang等[13]也報道了相似的結果，其將1 374個D5囊胚復蘇周期和255個D6囊胚復蘇周期進行分析，發現D5優質囊胚和D6優質囊胚的臨床妊娠率、種植率無顯著差異(分別為52.4% vs. 52.6%；38.9% vs. 35.6%)。故我們建議在進行復蘇周期囊胚移植時，應首先選擇評級高的囊胚；而在囊胚評級相同的情況下，優選D5形成的囊胚進行移植。

近期文獻報道，在新鮮周期中，囊胚的擴張程度、內細胞團評級和外滋養層評級與臨床妊娠率及活產率有密切聯系[14]。Kresowik等[15]的研究表明與非擴張期的囊胚相比移植擴張期的囊胚會得到更高的種植率。本研究選擇3期以上的囊胚進行冷凍，在期別上有較好的同質性，規避了囊胚不同期別對臨床結局的影響。另有一些研究表明無論在新鮮周期還是在復蘇周期中TE的評級對臨床結局最具預測價值[16-18]，移植ICM評級為A的囊胚能夠降低早期流產的風險[14]。與大多數文獻相同，我們對于囊胚的評分也采用了Gardner評分系統，但此系統對于ICM和TE形態學的描述較寬泛，因此不同的胚胎學家對囊胚評級帶有較大的主觀性。本研究中我們對于ICM和TE的評級采用了更具體的量化標準，減少了本實驗室不同的評分者之間的主觀差異。在此前提下，我們分析數據得出移植優質囊胚組的臨床妊娠率顯著高于非優質囊胚組，即ICM和TE評級高的囊胚其妊娠率也較高，這一結論與前人的報道一致。同時我們也關注到，有文獻研究表明囊胚的擴張程度、內細胞團評級和外滋養層評級三者之間可能存在內在的聯系。擴張程度高的囊胚其TE細胞數也較多，連接緊密，功能也比較好[16]。而ICM和TE之間也有關聯，囊胚評級為AA、BB、CC的概率高于其他組合[14]。因此更好地了解三種形態學參數之間的內在關聯有利于在選擇最優囊胚移植上達成共識。

眾多研究表明，多胎妊娠顯著增加妊娠期糖尿病、高血壓、剖宮產等產婦風險，同時也增加新生兒的早產率、低體質量兒率及死胎率[19]。因此為了保障單胎活產率，國內外領先的生殖中心已開始實施選擇性單囊胚移植。本研究的數據顯示復蘇周期中單優胚移植組的臨床妊娠率與雙優胚組之間無顯著性差異，因此對于<35歲，且有優質囊胚的患者應優先選擇單囊胚移植。

【參考文獻】

[1] Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology. Blastocyst culture and transfer in clinical-assisted reproduction： a committee opinion[J]. Fertil Steril，2013，99： 667-672.

[2] Zhu D，Zhang J，Cao S，et al. Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles—time for a new embryo transfer strategy?[J]. Fertil Steril，2011，95： 1691-1695.

[3] 何巧花，李杭生，張國玲，等. 新鮮囊胚與玻璃化冷凍囊胚復融周期移植的臨床結局比較[J]. 生殖醫學雜志，2014，23： 809-812.

[4] Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome： towards a single blastocyst transfer[J]. Fertil Steril，2000，73： 1155-1158.

[5] Yin H，Hong J，He R，et al. The effects of blastocyst morphological score and blastocoele re-expansion speed after warming on pregnancy outcomes[J].Clin Exp Reprod Med，2016，43： 31-37.

[6] Shu Y，Watt J，Gebhardt J，et al. The value of fast blastocoele re-expansion in the selection of a viable thawed blastocyst for transfer[J]. Fertil Steril，2009，91： 401-406.

[7] Shapiro BS，Daneshmand ST，Garner FC，et al. Contrasting patterns in in vitro fertilization pregnancy rates among fresh autologous，fresh oocyte donor，and cryopreserved cycles with the use of day 5 or day 6 blastocysts may reflect differences in embryo-endometrium synchrony[J]. Fertil Steril，2008，89： 20-26.

[8] 宋文妍，侯小漫，吳亮，等. 體外受精-胚胎移植周期中不同天數和發育階段囊胚移植妊娠結局的比較[J]. 生殖與避孕，2016，36： 807-815.

[9] Wang X，Zhen J，Sun Z，et al. Effects of fifth day(D5) or sixth day(D6) frozen-thawed blastocysts on neonatal outcomes[J].Zygote，2016，24： 684-691.

[10] Elgindy E，Elsedeek S E. Day 5 expanded blastocysts transferred on same day have comparable outcome to those left for more extended culture and transferred on day 6[J].J Assist Reprod Genet，2012，29： 1111-1115.

[11] Capalbo A，Rienzi L，Cimadomo D，et al. Correlation between standard blastocyst morphology，euploidy and implantation： an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts[J].Hum Reprod，2014，29： 1173-1181.

[12] Sunkara SK，Siozos Abolton VN，Khalaf Y，et al. The influence of delayed blastocyst formation on the outcome of frozen-thawed blastocyst transfer： a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod，2010，25： 1906-1915.

[13] Yang H，Yang Q，Dai S，et al. Comparison of differences in development potentials between frozen-thawed D5 and D6 blastocysts and their relationship with pregnancy outcomes[J].J Assist Reprod Genet，2016，33： 865-872.

[14] Van DE，Balaban B，Ziebe S，et al. Association between blastocyst morphology and outcome of single-blastocyst transfer[J/OL].Reprod Biomed Online，2013，27： 353-361.

[15] Kresowik JDK，Sparks AET，Van Voorhis BJ. Clinical factors associated with live birth after single embryo transfer[J]. Fertil Steril，2012，98： 1152-1156.

[16] Ahlstr?m A，Westin C，Reismer E，et al. Trophectoderm morphology： an important parameter for predicting live birth after single blastocyst transfer[J].Hum Reprod，2011，26： 3289-3296.

[17] Hill MJ，Richter KS，Heitmann RJ，et al. Trophectoderm grade predicts outcomes of single-blastocyst transfers[J]. Fertil Steril，2013，99： 1283-1289.

[18] Honnma H，Baba T，Sasaki M，et al. Trophectoderm morphology significantly affects the rates of ongoing pregnancy and miscarriage in frozen-thawed single-blastocyst transfer cycle in vitro fertilization[J]. Fertil Steril，2012，98： 361-367.

[19] 來天嬌，郭藝紅. 多胎妊娠減胎術倫理爭議[J]. 生殖醫學雜志，2017，26： 219-223.