月經發生中低氧誘導因子-1A對VEGF的調節

郭士格，南楠，尹德東，周芳，王樹芳，劉建兵，賀斌，王介東，徐祥波，陳西華*

(1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081；3.新鄉醫學院，新鄉 453003；4.山西醫科大學，太原 030001)

月經是女性重要的生理現象，子宮內膜異常出血嚴重影響女性的生活質量，每年尋求治療的婦女數量龐大[1]。但是有關人類月經生理和病理的許多問題仍沒有得到解答。

Markee[2]將兔的子宮內膜移植于雌性獼猴眼前房內，觀察到蛻膜化的子宮內膜在孕酮撤退后，螺旋動脈強烈收縮，推測螺旋動脈收縮引起的組織低氧是造成子宮內膜崩解的關鍵因素。低氧誘導因子HIF1A是應答低氧的首要轉錄因子[3]。在低氧條件下，HIF1A的降解受到阻斷，HIF1A轉運到細胞核與HIF1B形成異源二聚體[4]，結合于DNA中的低氧反應元件并調控下游基因表達。本研究采用的HIF1A抑制劑甲氧雌二醇(Methoxyestradiol，2ME)具有解聚微管蛋白的作用，從而抑制HIF1A進入細胞核[5]。

血管內皮生長因子(VEGF)是一個編碼HIF1A轉錄活性的關鍵應答基因[6]。VEGF的所有亞型及其受體均在子宮內膜中表達[7]。VEGF在女性增殖期中期表達上調并且促進血管增生[8-10]。

有研究分別利用人子宮內膜組織塊、人內膜基質原代細胞進行體外培養，探討了孕酮撤退和低氧對VEGFmRNA的調節作用[11-12]。但是在活體內，孕酮撤退后HIF1A是否直接與VEGF基因的上游啟動子結合并調節其表達，并未明確闡述。本科室前期研究表明[13]，小鼠月經樣模型崩解期，孕酮撤退后Vegf與Hif1amRNA的表達變化趨勢隨著時間的推移變化基本一致；HIF1A蛋白進入細胞核，轉錄活性被激活，且其達峰時間點與VegfmRNA達峰時間點一致。本研究進一步以小鼠月經樣模型為基礎，研究HIF1A對VEGF的調控作用與調控關系，并在小鼠月經樣模型中證明HIF1A能夠直接調控VEGF的表達，并在體外培養模擬月經發生的人蛻膜化子宮內膜基質細胞中得到驗證。

材料和方法

一、實驗動物及細胞材料來源

實驗動物：8～10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ)，根據國家衛計委科學技術研究所動物倫理委員會許可批準進行實驗。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物，光照8：00～20：00，溫度(20±1)℃。

取術前三個月未用任何激素藥物給予子宮切除手術的子宮肌瘤患者增殖中、晚期或分泌早期子宮內膜用于人子宮內膜基質細胞分離培養。

二、研究方法

1.小鼠月經樣模型的建立及HIF1A抑制劑干預實驗：據前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經樣模型[14]。蛻膜化2 d后移去孕酮皮下埋植管時記為0 h。抑制劑組分別在孕酮撤退前4 h、撤退后4 h與12 h共3個時間點以腹腔注射的方式給予HIF1A抑制劑2ME 100 mg/kg(Selleck，美國)；對照組處理為同樣時間給予等量2ME的溶媒溶液。在孕酮撤退后24 h取材，-80°C保存。

2. 染色質免疫共沉淀(ChIP)：據ChIP試劑盒(Cell Signaling，美國)操作說明書，取小鼠月經樣模型孕酮撤退后0 h、8 h、12 h、16 h和24 h的-80°C凍存小鼠子宮，加入PBS+蛋白酶抑制劑Cocktail(PIC)溶液并剪碎；加入37%甲醛450 μl，室溫搖床孵育20 min進行蛋白質-DNA交聯反應。隨后加入Glycine終止反應；樣品達到單細胞狀態，依次加入Buffer A/B，加入10～15 μl Micrococcal Nuclease，使樣品DNA被分解成150～900 bp的片段，加入100～150 μl 0.5 mol/L EDTA，終止反應；破碎細胞，收集上清完成交聯染色體制備；用ChIP Buffer將樣品稀釋至100 μg/ml；分別加入沉降抗體：HIF1A 1 μl(1：500)(Novus，美國)、H3陽性對照組蛋白H3抗體10 μl、陰性對照正常兔IgG抗體1 μl，4°C搖床孵育過夜；各樣品加入30 μl ChIP沉降珠，4°C搖床孵育2 h；離心后保留沉淀，隨后沉降珠洗脫，樣品純化，最后利用實時熒光定量PCR檢測目標序列的相對含量。

表1 引物序列

3.Western blot檢測：-80℃保存的小鼠子宮組織分別提取核蛋白與胞質蛋白，加入適量蛋白酶抑制劑；將40～50 μg蛋白質進行10%SDS-PAGE膠電泳，轉移至PVDF膜后，分別進行VEGF(Santa Cruz，美國)、HIF1A(Novus，美國)、β-ACTIN(北京康為世紀生物)、LAMIN-B抗體(Santa Cruz，美國)雜交，用ECL發光試劑盒(北京全式金生物)檢測。

4.人蛻膜化子宮內膜基質細胞體外模擬月經發生：主要試劑為DMEM/F12(Gibco，美國)、雌二醇(E2)(Alfa Aesar，美國)、甲羥孕酮(MPA)(Sigma，美國)、Charcoal stripped FBS(Invitrogen，美國)。據前期研究報道建立人子宮內膜基質細胞蛻膜化模型[15]，原代培養2 d后，換成維持培養基(無酚紅DMEM/F12+抗生素+MPA 10-7mol/L、E210-8mol/L)培養12～24 h；更換無激素培養基模擬月經發生(DMEM/F12無酚紅+10% Charcoal-stripped FBS+抗生素)，記為0 h；在處理后0 h、12 h、24 h和36 h收集細胞。

5. 實時熒光定量PCR：將-80℃保存的樣本，TRIzol法提取總RNA。將總RNA與Random primer及Oligo(dT)混合，70℃孵育10 min，迅速于冰上冷卻2～3 min，配制逆轉錄體系，30℃孵育10 min，42℃孵育60 min，70℃孵育15 min，最后冰上冷卻，獲得cDNA文庫；用實時熒光定量PCR檢測VEGF和HIF1AmRNA的表達量。所用主要試劑Real-Time PCR kit(SYBR寶生物工程)，引物序列見表1。

6.人蛻膜化內膜基質細胞HIF1A敲降實驗：敲降組采用激素維持培養基(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L)+Hif1a敲降；相應的陰性對照組中轉染無義序列。無抗生素無血清激素維持培養基(無酚紅DMEM/F12+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L)，37°C培養24 h。轉染試劑為LipofectamineTM2000(Thermo Fisher，美國)，具體步驟參照產品說明書。轉染特異性HIF1A的siRNA序列(Gene Pharma，上海)24 h后完成敲降過程，將培養基更換成無激素培養基模擬月經發生(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS)，記為0 h。分別在0、12、24、36 h共4個時間點收集細胞，Real-time PCR方法檢測VEGFmRNA表達量。

四、統計學方法

結 果

一、HIF1A與Vegf基因在小鼠月經樣模型孕酮撤退后的結合

孕酮撤退后，ChIP實驗結果顯示HIF1A結合Vegfpromoter的相對含量在0 h較低，隨后逐漸上升，在12 h達到峰值(P<0.01)，在16 h迅速降低，24 h隨后略上升，但顯著低于12 h峰值(P<0.01)(圖1)。

二、小鼠月經樣模型中HIF1A抑制劑對HIF1A-VEGF調控的影響

圖1 小鼠月經樣模型崩解期HIF1A結合Vegf promoter區域的相對含量

在小鼠月經樣模型中給予2ME抑制HIF1A功能，于孕酮撤退后24 h檢測HIF1A和VEGF蛋白的表達。HIF1A在子宮組織細胞質中的表達在抑制劑組較陰性對照組中高(P<0.01)(圖2A)，而胞核中，在抑制劑組中較對照組低(P<0.05)(圖2B)。抑制劑組中VEGF在胞質的表達量較對照組低(P<0.01)(圖2C)。

A：胞質中HIF1A蛋白Western blot結果與相對表達量；B：胞核中HIF1A蛋白Western blot結果及相對表達量；C：胞質中VEGF蛋白Western blot結果與相對表達量；相互比較，*P<0.01圖2 小鼠月經樣模型中HIF1A抑制劑(2ME)對子宮組織HIF1A-VEGF調控的影響

三、HIF1A 與VEGF mRNA在體外模擬月經發生(激素撤退)的人蛻膜化內膜基質細胞中的表達

HIF1A與VEGFmRNA均在0 h處于較低水平，12 h略上升；與12 h相比，HIF1AmRNA在24 h、36 h顯著升高(P<0.01)，約為12 h的表達量的3倍，VEGFmRNA的表達升高更為明顯(P<0.01)(圖3)。

四、采用siRNA敲降HIF1A對HIF1A-VEGF調控的影響

使用HIF1AmRNA特異性siRNA轉入蛻膜化人ESC細胞后，HIF1AmRNA敲降效率在敲降后0 h為90%，在48 h敲降效率為88%(圖4A)。陰性對照組，VEGFmRNA表達量在激素撤退后呈上升趨勢，在0 h表達量最低，12 h略上升，在24 h和36 h表達量顯著高于12 h(P<0.01)，且36 h的表達量進一步顯著升高(P<0.01)；而HIF1A敲降組，VEGFmRNA的表達雖略有上升，但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01)，且VEGFmRNA的表達量在24 h和36 h僅約為陰性對照組的1/2(圖4B)。

A：HIF1A mRNA的表達；B：VEGF mRNA的表達；相互比較，*P<0.01圖3 孕酮撤退后HIF1A和VEGF mRNA在蛻膜化人子宮內膜基質細胞的表達

A：HIF1A敲降效率；B：陰性對照組與HIF1A敲降組中VEGF mRNA的相對表達量；相互比較，*P<0.01圖4 HIF1A敲降對于孕酮撤退后蛻膜化人內膜基質細胞VEGF mRNA表達的影響

討 論

本研究在小鼠月經樣模型中探究HIF1A與VEGF的表達及其調控關系。結果顯示，在孕酮撤退0-24 h，HIF1A結合的Vegfpromoter的相對含量變化趨勢先升高后降低并在12 h達到峰值(P<0.05)。VegfmRNA在12 h出現的峰值與此時HIF1A與Vegfpromoter的結合關系緊密[13]，提示孕酮撤退后HIF1A入核激活，并啟動下游調控基因VegfmRNA的表達。2ME抑制HIF1A入核活化的同時，VEGF表達顯著降低(P<0.05)。綜上證明，小鼠月經樣模型在孕酮撤退后HIF1A進入細胞核，其轉錄因子功能被激活，并啟動下游調控基因VegfmRNA的表達。

我們進一步在體外培養的人蛻膜化內膜基質細胞中驗證HIF1A對VEGF的直接調節關系。結果顯示，HIF1A和VEGFmRNA均在0 h處于較低的水平，在12 h略上升，在24 h、36 h表達量顯著升高(P<0.01)。也就是說孕酮撤退顯著上調HIF1A和VEGFmRNA的表達量。體外培養的人蛻膜化內膜基質細胞在孕酮撤退后，VEGFmRNA在HIF1A敲降組的表達雖略有上升，但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01)。綜上證明，在小鼠月經樣模型和體外培養的人蛻膜化內膜基質細胞中，孕酮撤退后HIF1A入核，其轉錄因子活性被激活，并啟動下游調控基因VegfmRNA的表達。

低氧誘導因子HIF1A是應答低氧的主要轉錄因子[3]。2002年Zhang等[16]發現HIF1A僅在少數分泌晚期和月經期前的人子宮內膜中表達。2006年，Critchley等[17]發現HIF1A蛋白和HIF1AmRNA在分泌期功能層人子宮內膜，特別是月經期人子宮內膜組織中高表達。低氧條件下，HIF1A的降解被阻斷，HIF1A積累并與HIF1B結合形成異源二聚體轉運至細胞核內，與基因組中的低氧反應元件結合，調控下游靶基因的轉錄與表達。血管內皮生長因子VEGF是一個編碼HIF1A轉錄活性的關鍵應答基因[6]。本科室前期研究表明，在小鼠月經樣模型崩解期，孕酮撤退后VEGF與HIF1AmRNA的表達量時相變化相一致[13]。

本研究以小鼠月經樣模型為基礎，明確了在孕酮撤退后HIF1A轉錄因子功能被激活，并直接結合于Vegfpromoter區，啟動下游調控基因VegfmRNA的表達。進一步利用人子宮內膜基質細胞體外培養模擬月經發生(激素撤退)，驗證了HIF1A對VEGF的直接調節關系。

子宮內膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。闡明子宮內膜崩解出血生理機制，有助于促進異常出血機制的研究、治療策略探尋及女性生殖健康水平的提升。

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