精子頂體相關基因SPACA7的轉錄活性研究

張菁華，周永翠，唐愛發*

(1.中山大學中山醫學院，廣州 510275；2.深圳市第二人民醫院轉化醫學研究院，深圳 518037)

本實驗室前期研究中，采用Affymetrix公司的小鼠全基因組表達譜芯片篩選出一批睪丸特異性表達新基因，其中一個睪丸特異性基因是SPACA7(原命名為T279)，小鼠不同組織、器官、細胞系的高通量基因表達模式顯示，SPACA7僅在睪丸組織中特異表達[1]。SPACA7屬于精子頂體結合蛋白家族成員，該蛋白家族成員只有SPACA3和SPACA5具有較高的氨基酸同源性，其它成員同源性不高。有報道表明，在小鼠雄性生殖細胞發生過程中有超過50%的基因組基因發生表達，但是僅僅只有4%的基因組基因發生轉錄?；蜣D錄調控對于該基因的時空表達以及表達強度等至關重要，本文旨在通過分析SPACA7 16對啟動子的轉錄活性，篩選SPACA7的有效啟動子，為日后研究SPACA7的基因轉錄調控做基礎。

資料與方法

一、研究對象及試劑

1.研究對象：人腎上皮細胞293T(購自美國模式培養物集存庫ATCC，CRL-3216)。

2.主要試劑：pGL3-basic、Renilla質粒和Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；逆轉錄試劑盒、高保真DNA聚合酶primer STAR、DNA聚合酶ExTaq以及相關PCR試劑購自日本TakaRa公司；RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自美國QIAGEN公司；限制性內切酶XhoⅠ、HindⅢ 和T4DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司；無內毒素質粒大量抽提試劑盒和Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清及培養基購自美國Gibco公司。

3.主要儀器：PCR儀(ABI Veriti，美國)、凝膠成像系統(Bio-Rad GelDoc，美國)、酶標儀(THERMO FISHER Multiskan FC，美國)。

二、實驗方法

1.SPACA7基因啟動子序列獲取及引物設計和合成：使用Promoter 2.0和Neural Network Promoter Prediction對SPACA7基因啟動子進行分析，在NCBI的GeneBank中查找，獲取人類SPACA7基因轉錄起始位點上游2000 bp與下游84 bp序列。利用Primer Premier 5.0軟件設計16對啟動子引物(表1)，上游引物含XhoⅠ酶切位點和保護堿基，下游引物含HindⅢ 酶切位點和保護堿基。

表1 PCR引物序列

2.細胞培養：293T細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中，在含5% CO2的37℃培養箱中培養，每兩天進行傳代培養。

3.人腎上皮細胞293T基因組DNA提?。捍臃N于T25培養瓶的293T細胞生長至對數生長期、80%左右融合度時，棄去培養基，1×PBS清洗3次，用細胞刮刮下細胞，收集于離心管中，參照QIAGEN基因組DNA提取試劑盒說明書提取293T細胞基因組DNA。

4. PCR擴增SPACA7啟動子序列和pGL3-basic表達載體構建：以上述提取的基因組DNA為模板，采用高保真DNA聚合酶擴增相應的DNA片段。PCR反應程序如下：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s至2 min，30個循環；72℃延伸7 min；4℃+∞。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行凝膠回收。XhoⅠ和HindⅢ 雙酶酶切膠回收產物和pGL3-basic載體。上述酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳和凝膠回收純化，將純化回收的不同長度的啟動子片段與載體大片段進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，測序進行鑒定。

5.細胞轉染及熒光素酶活性檢測：經測序鑒定成功的質粒菌種進行無內毒素大量質粒抽提，轉染前用無血清DMEM培養基稀釋各質粒濃度至1 μg/μl，將重組質粒與內參pRL-TK同時轉染細胞，pGL3-SPACA7和Renilla的用量分別為1 μg/孔和0.02 μg/孔，轉染試劑為2 μg/孔。轉染12 h后，給細胞換新鮮的培養基，24 h后收集細胞，吸掉培養基后用1×PBS清洗三次，然后加入100 μl裂解液室溫下輕緩晃動15 min，收集細胞裂解液，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System說明書，使用Thermo VARIOSCAN FLASH 3001多功能酶標儀測定熒光素酶活性。每次實驗設置3個復孔，同一轉染實驗重復3次，取其平均值。

三、統計分析

獨立實驗重復至少三次；數據由SPSS軟件(SPSS Inc，Chicago，IL)處理。

結 果

一、SPACA7基因的篩選和鑒定

我們采用人全基因組芯片與胚胎睪丸探針和成人睪丸探針差異雜交篩選出一個在成人睪丸中高表達的SPACA7基因。采用小鼠和人同源基因比較分析，我們找到了相應的小鼠同源基因，我們研究發現小鼠Spaca7基因的芯片雜交信號校正值在4、9、18、35、54日齡和6月齡小鼠睪丸中分別為0.9、0.2、3.9、659.8、726.3和793.6，可見Spaca7基因在18日齡之前小鼠睪丸組織中基本不表達，在18日齡之后才開始表達，并隨日齡的增加表達逐漸增強(圖1A)。

為了驗證上述GeneChip結果，我們對4、6、9、11、15、19、24、31、36、40和54天小鼠的睪丸組織進行RT-PCR分析，結果顯示Spaca7轉錄本僅在出生后15 d的睪丸組織中開始檢測到，且隨著日齡的增加其表達逐漸增強(圖1B)。RT-PCR分析結果與上述不同日齡小鼠睪丸的芯片分析結果有細微的差別，但在整體上都反映出Spaca7基因的表達呈現年齡依賴性特征。由此可見，Spaca7基因在小鼠睪丸組織中的表達具有時間依賴性，幼年期不表達，成年期高表達，提示Spaca7基因主要在成年期小鼠睪丸組織中發揮作用。

A：小鼠Spaca7基因在不同日齡小鼠睪丸中的GeneChip雜交值；B：RT-PCR分析Spaca7基因在不同日齡小鼠睪丸中的表達特征；d：日齡；NC：陰性對照圖1 小鼠Spaca7基因的GeneChip和RT-PCR分析

二、SPACA7基因的生物信息學分析

人SPACA7基因(GeneBank登錄號：NM_145248)定位于染色體13q34位點，其cDNA長度773 bp，在32～619 bp之間有一閱讀框，含有588 bp的完整開放閱讀框，編碼一個由195個氨基酸組成、分子量為21.48 KDa的蛋白質，等電點4.65，32～34處為起始密碼子ATG，617～619處為終止密碼子TGA，SPACA7蛋白在1～19位氨基酸處有跨膜區。將SPACA7 cDNA序列輸入數據庫進行不同物種序列BLAST比對發現小鼠睪丸有同源基因Spaca7(GenBank登錄號：NM_024279)，其定位于染色體8A2位點，其cDNA長度761 bp，開放閱讀框549 bp，編碼一個182個氨基酸，分子量為19.94 KDa的蛋白質，等電點4.56，58～60 bp處為起始密碼子ATG，604～606 bp處為終止密碼子TAG。人和小鼠SPACA7基因的核苷酸序列達到64.5%的同源性，其編碼的蛋白氨基酸序列比對相同率達到45%(圖2)，說明SPACA7是一個人-鼠同源基因。

三、SPACA7啟動子的克隆與鑒定

以293T細胞基因組DNA為模板，表一所列引物，進行PCR擴增，得到一系列大小不同的特異性條帶(圖3)。將PCR產物純化之后酶切、連接，得到重組質粒，測序結果與NCBI記錄信息一致。

圖2 SPACA7基因核苷酸序列在人和小鼠中的同源性比較

圖3 SPACA7啟動子克隆PCR產物

四、雙熒光素酶檢測結果

將構建成功的pGL3-SPACA7重組質粒轉染到293T細胞中，收集細胞并對細胞裂解液進行雙熒光素酶報告基因檢測，結果顯示，轉染了pGL3-Basic空載質粒(VEC)的陰性對照組比其它的重組質粒轉染組熒光活性都要低，說明各重組質粒轉染到293T細胞后均表現出了啟動子活性。通過比較16個不同長度啟動子與空載體的相對熒光素酶活性，其中以pGL3-SPACA7-F2(-1 500 bp～+84 bp)啟動子活性最強(圖4)。

圖4 熒光素酶檢測結果

討 論

迄今為止，各國科學家采用基因芯片和生物信息學分析等技術，推測哺乳動物精子發生過程中表達的睪丸特異性基因達2 300多個[2]，它們參與生物發育過程的各個階段，如染色質包裝(Prm1[3]、Prm2[4]、Prm3[5]、Tnp1[6]、Tnp2[6]、H1FNT[7])，精子尾部形成(Tektin-t[8]、Vdac3[9]、Sepp1[10]、Akap4[11]、Spag6[12]、MEIGI[13])，能量代謝(Gapds[14]、sAC[15]、SLO3[16]、PRSS21[17])，頂體形成(Agfg1[18]、Gopc[19]、CD59b[20]、GBA2[21]、SPATA16[22])，透明帶結合和信號傳導(Tenr[23]、Clgn[24]、Catsper1-4[25])等重要過程，因此研究睪丸特異性表達基因具有重要意義。

我們利用啟動子截短實驗獲得了SPACA7不同長度系列啟動子16個，對其進行了熒光素酶活性檢測，發現在-1 500 bp至+84 bp區域具有較強轉錄活性，而-2 000 bp至+84 bp區域啟動子轉錄活性較低，說明在-2 000 bp至-1 500 bp區域啟動子上可能存在一段增強子，促進SPACA7基因的表達，而與該增強子相互作用的反式作用因子還需進一步實驗。

SPACA7在人類、小鼠、黑猩猩、獼猴中有同源物，但是這些蛋白沒有保守的結構域，并且其功能尚不明確。已知SPACA家族成員具有相似的表達定位，因此研究SPACA的轉錄表達具有重要意義。生物信息學分析發現SPACA7的啟動子上具有AP1、USF、GATA-1、MZF1、SRY和RUNX1等轉錄因子結合位點，其中SOX基因家族主要在減數分裂后的生殖細胞中特異表達，在圓形精子中表達量最高。SOX基因家族成員是否參與SPACA7的基因表達調控還需進一步的實驗證實，這里我們鑒定到了具有高轉錄活性的SPACA7啟動子對其表達調控的研究具有重要意義。

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