β-氨基丙腈抑制機械刮宮后大鼠子宮內膜纖維化的研究

倪冬冬，徐祥波，賀斌，王藹明

(1.第二軍醫大學，上海 200433；2.海軍總醫院，北京 100048；3. 國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081)

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)是指任何創傷引起的子宮內膜基底層的損傷導致子宮內膜纖維化從而形成子宮腔前后壁粘連。宮腔粘連的發生有多種，但最常見的原因是由機械性刮宮引起的子宮內膜基底層損傷，比如人工流產等宮腔內手術操作等。其臨床表現為月經異常、繼發性不孕等[1]。隨著臨床宮腔操作的增多以及宮腔鏡技術的應用，IUA的發病率和診斷率顯著上升[2-3]。目前研究已發現多種與宮腔粘連發生相關的因素，但宮腔粘連的發病機制尚不清楚[4]，對較重的子宮內膜纖維化也無有效的治療方法。宮腔粘連的本質是子宮內膜基底層損傷后導致的子宮內膜纖維化[5]。成九梅等[6]通過研究發現IUA患者的子宮內膜中有大量細胞外基質沉積，子宮內膜逐漸被纖維結締組織取代，最終形成IUA。賴氨酰氧化酶(1ysyl oxidase，LOX)是由細胞分泌的、作用于細胞外基質膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基從而產生分子交聯的一種胺氧化酶，參與膠原纖維與彈性纖維共價交聯的形成過程[7-8]。共價交聯的形成對膠原纖維的穩定至關重要[9-10]，它在肝臟、肺臟等多個器官纖維化的過程中發揮重要作用[11]。β-氨基丙腈作為賴氨酰氧化酶抑制劑能夠逆轉肝臟的纖維化[12]。因此探索β-氨基丙腈是否對大鼠子宮內膜纖維化有逆轉作用以及最佳的使用劑量，將為宮腔粘連的發生機制及治療方法的研究提供重要實驗基礎。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

1.實驗動物：8周齡雌性Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)，體重180～230 g，大鼠飼養于國家衛生計生委科學技術研究所SPF級實驗動物中心，環境溫度20～22℃，光照/黑暗周期為12/12 h，自由進食正常飼料。所有大鼠實驗操作均遵守國家衛生計生委科學技術研究所倫理委員會的相關規定。

2.主要試劑：β-氨基丙腈(beta-aminopropionitrile，BAPN)(Sigma，美國)；Masson染色試劑(北京索萊寶)；羥脯胺酸試劑盒(南京建成生物)。

二、實驗方法

1.實驗動物分組：54只雌性Wistar大鼠用隨機數字表法分為正常組(6只)，不給予任何處理；對照組(12只)，建立大鼠子宮機械損傷致宮腔纖維化粘連模型；實驗組(36只)，建立大鼠子宮機械損傷致宮腔粘連模型，并立即腹腔注射β-氨基丙腈。

2.β-氨基丙腈劑量組：曾有研究采用100 mg/kg/d劑量β-氨基丙腈作為賴氨酰氧化酶抑制劑來研究賴氨酰氧化酶在大鼠的不同作用[13-14]。因此，我們以100 mg/kg/d劑量為實驗用最低劑量，按照每天注射β-氨基丙腈劑量不同分為3個劑量組：100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg，每組12只。

3.大鼠子宮機械損傷致宮腔纖維化粘連模型的建立及標本收集：將大鼠用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉后，在超凈工作臺上實施刮宮手術，在雙側背部備皮消毒后切開，取出子宮，在子宮角近卵巢約5 mm處剪開一小口，用12-18號不銹鋼針頭自制刮勺，探入宮腔反復搔刮子宮，至刮出子宮內膜碎屑宮腔面粗糙，縫合子宮，逐層縫合關閉大鼠背部切口。對照組自然愈合，實驗組搔刮后立即腹腔每日一次注射 100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg的β-氨基丙腈。對照組和實驗組分別于搔刮后72 h、7 d用0.2%苯巴比妥麻醉后每組各取6只大鼠雙側子宮，觀察記錄子宮大體形態后，部分損傷子宮4%多聚甲醛固定，部分損傷子宮液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存，取材后大鼠斷頸處死。

4.蘇木精-伊紅(HE)染色：選取正常組、對照組和實驗組損傷子宮中段組織，常規石蠟包埋，5 μm連續切片，切片常規脫蠟、水化，蘇木素染液中浸染5 min后用清水洗去多余染液，用1%鹽酸酒精將組織切片分化30 s，流水沖洗返藍，放入伊紅染液中浸染20～30 s，清水洗去多余伊紅染液，將組織切片常規梯度脫水、透明，最后用中性樹膠封片。

5.Masson染色：將組織切片常規脫蠟至水，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，用酸性乙醇分化液分化5～15 s，水洗后Masson藍化液返藍3～5 min，蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色5～10 min，用弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min后再用弱酸工作液洗1 min；放入苯胺藍染色液中染色1～2 min后弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s，最后用二甲苯透明，中性樹膠封片。

6.大鼠子宮膠原含量檢測：羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸，通過羥脯氨酸的測定，可以反映膠原蛋白的含量。取大鼠子宮凍存組織100 mg，等分兩份。一份組織剪碎后放入試管中，加入5 mg/ml的胃蛋白酶和0.5 mol/L的三氯乙酸4℃過夜消化后以2 000 rpm、4℃低溫離心，上清含有可溶性膠原，離心后的沉淀含有不可溶性膠原[13]。用羥脯胺酸測試盒按說明書操作檢測上清液中羥脯胺酸含量。簡要操作步驟：將離心后的上清液中加水解液1 ml，混勻，加蓋后放入95 ℃或沸水中20 min，調pH值至6.0～6.8，取3～4 ml稀釋的水解液加適量活性炭(約20～30 mg，以上清液離心后澄清無色為準)，3 500 rpm離心10 min，然后取上清1 ml在550 nm處檢測吸光度，用測得的OD值按公式計算出羥脯胺酸含量從而得到可溶性膠原含量。然后將另一份等量大鼠子宮組織，剪碎后直接加入水解液1 ml，之后按上述相同方法測得上清液中的羥脯胺酸含量來計算出總膠原的含量，最后用總膠原量減去可溶性膠原量即得到不可溶性膠原量。

三、統計學方法

結 果

一、大鼠一般情況

在子宮搔刮后及愈合過程中，對照組大鼠一般情況良好；實驗組大鼠中給予β-氨基丙腈100 mg/kg、200 mg/kg劑量組大鼠一般情況及精神狀態均良好，給予300 mg/kg劑量組大鼠一般狀況差，大鼠消瘦、精神狀態萎靡，運動遲緩；實驗過程中β-氨基丙腈300 mg/kg劑量組有1只死于第5天，2只死于第7天。

二、大鼠子宮大體形態學結果

子宮大體形態學觀察結果顯示：與大鼠正常組未損傷子宮(圖1A)相比，對照組子宮搔刮損傷后72 h呈現輕微攣縮且子宮表面凸凹不平結節樣(圖1B)，至7 d時子宮僵硬攣縮明顯且子宮表面蒼白(圖1C)。

與對照組相比，實驗組各劑量組在子宮搔刮損傷后72 h時大體外觀基本正常，無明顯萎縮、淤血，有輕度水腫(圖1D、E、F)；至7 d時，實驗組各劑量組大鼠子宮與正常大鼠子宮(圖1A)未見明顯差異，色澤紅潤，組織彈性好(圖1G、H、I)。

三、大鼠子宮組織形態學結果

HE染色結果顯示，與正常組未損傷子宮(圖2A)相比，對照組大鼠子宮搔刮損傷后72 h可見損傷的子宮腔被上皮細胞完全覆蓋，但子宮內膜很薄(圖2B)；至搔刮損傷后7 d，對照組大鼠子宮腔萎縮最嚴重，內膜薄，腺體少，宮腔狹小，內膜基質纖維組織增生(圖2C)。

搔刮損傷后72 h，實驗組BAPN 100 mg/kg劑量組大鼠子宮腔被上皮細胞完全覆蓋，子宮內膜較厚，內膜基質纖維組織增生較對照組少，腺體數量較對照組多(圖2D)；BAPN 200 mg/kg劑量組大鼠子宮腔被上皮細胞完全覆蓋，子宮內膜較其他實驗組及對照組大鼠子宮內膜厚，內膜基質纖維組織增生少，腺體數量較100 mg/kg劑量組多(圖2E)；300 mg/kg劑量組大鼠子宮內膜薄，腺體數量較200 mg/kg劑量組少(圖2F)。

至搔刮損傷后7 d時，實驗組100 mg/kg劑量組大鼠子宮腔大部分被上皮細胞覆蓋，子宮內膜較薄，腺體數量較200 mg/kg劑量組少(圖2G)；200 mg/kg劑量組大鼠子宮內膜較其他實驗組及對照組大鼠子宮內膜厚，腺體數量較多(圖2H)；300 mg/kg劑量組大鼠子宮內膜薄，腺體數量減少，腺腔狹小(圖2I)。

A：正常大鼠子宮；B：搔刮損傷后72 h對照組大鼠子宮；C：搔刮損傷后7 d對照組大鼠子宮；D、E、F：分別是100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組連續給藥72 h的實驗組大鼠子宮；G、H、I：分別是100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組連續給藥7 d的實驗組大鼠子宮圖1 各組大鼠子宮的大體形態結果

四、Masson染色結果

與正常組未損傷子宮(圖3A)相比，對照組搔刮損傷后72 h(圖3B)及7 d時(圖3C)子宮內膜組織中藍染膠原纖維逐漸增多，提示在子宮損傷后愈合過程中伴有明顯的纖維化。與對照組相比，在子宮搔刮損傷后72 h，實驗組各劑量組(圖3D、E、F)子宮內膜組織中藍染膠原纖維含量減少，以200 mg/kg及300 mg/kg劑量組較為明顯；至7 d時，實驗組各劑量組(圖3G、H、I)子宮內膜組織中藍染膠原纖維含量比對照組(圖3C)明顯減少。

五、羥脯胺酸試劑盒檢測膠原含量結果

羥脯氨酸檢測結果顯示，在子宮搔刮損傷后72 h，對照組不可溶膠原纖維含量[(5.61±0.31) μg/mg]顯著高于實驗組三個劑量組(P<0.01)，而實驗組中200 mg/kg劑量組不可溶膠原纖維含量低于100 mg/kg劑量組[(1.88±0.33) μg/mg vs.(3.59±0.27)μg/mg，P<0.05)]，但與300 mg/kg劑量組[(1.91±0.21)μg/mg]無顯著差異(P>0.05)(表1)。

搔刮損傷后第7天，對照組大鼠子宮不可溶膠原纖維含量[(6.18±0.23)μg/mg]顯著高于正常組(P<0.01)；實驗組三個劑量組盡管也高于正常組(P<0.05)，但顯著低于對照組(P<0.01)，其中實驗組200 mg/kg劑量組不可溶膠原纖維含量顯著低于100 mg/kg組[(1.90±0.31)μg/mg vs.(3.98±0.22)μg/mg，P<0.05)]，但與300 mg/kg劑量組無顯著差異(P>0.05)(表1)。

對照組和300 mg/kg劑量組的可溶性膠原含量在損傷后72 h和7 d時顯著高于正常組(P<0.05)，而對照組與實驗組間、實驗組各劑量組間的可溶性膠原含量無統計學差異(P>0.05)(表1)。

A：正常大鼠子宮；B：搔刮損傷后72 h對照組大鼠子宮；C：搔刮損傷后7 d對照組大鼠子宮；D、E、F：分別是搔刮損傷后72 h實驗組100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組的大鼠子宮；G、H、I：分別是搔刮損傷后7 d實驗組100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組的大鼠子宮圖2 各組大鼠子宮橫切面組織學結果(HE染色，×100)

組別72h7d可溶性膠原不可溶性膠原可溶性膠原不可溶性膠原正常組0.90±0.121.11±0.401.10±0.091.23±0.27對照組1.40±0.19a5.61±0.31a1.81±0.17a6.18±0.23a實驗組 100mg/kg1.18±0.143.59±0.27abc1.41±0.183.98±0.22abc 200mg/kg1.22±0.091.88±0.33ab1.32±0.111.91±0.31ab 300mg/kg1.64±0.11a1.91±0.21ab1.73±0.15a2.21±0.37ab

注：與正常組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；與實驗組中其他劑量組比較，cP<0.05

A：正常大鼠子宮；B：搔刮損傷后72 h對照組大鼠子宮；C：搔刮損傷后7 d對照組大鼠子宮；D、E、F：分別是搔刮損傷后72 h實驗組100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組的大鼠子宮；G、H、I：分別是搔刮損傷后7 d實驗組100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg劑量組的大鼠子宮圖3 各組大鼠子宮橫切面Masson染色結果(×200)

討 論

IUA是由于各種原因導致的子宮內膜基底層損傷。IUA主要發生于妊娠期的宮腔操作后及其他疾病行宮腔手術治療之后[14]。宮腔粘連可導致不孕、月經量減少、閉經、腹痛等癥狀[15]。目前宮腔粘連的發病機制不清楚，重度宮腔粘連的治療效果差。因此，探索 IUA 的發病機制，尋求有效治療靶點來阻斷子宮內膜纖維化的發生、預防宮腔粘連的形成顯得尤為重要。

本實驗通過大鼠子宮機械性搔刮損傷建立大鼠子宮搔刮損傷后纖維化修復模型，在此基礎上探討β-氨基丙腈在抑制大鼠子宮內膜損傷后纖維化中的作用及最佳使用劑量。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)是一種細胞外依賴銅的氨基酸氧化酶，參與細胞外基質中膠原和彈性蛋白賴氨酸殘基交聯，在膠原和彈性蛋白由可溶性單體轉變為不溶性纖維過程的初始階段發揮重要作用，對維持細胞外基質的結構和功能正常、組織器官發育、創傷修復、細胞運動等都具有重要意義[16]。β-氨基丙腈通過與賴氨酰氧化酶家族的活性位點形成共價加合物來抑制賴氨酰氧化酶家族的活性從而導致其無法催化膠原交聯的形成，是特異性的、不可逆的LOX抑制劑[17-18]。研究表明賴氨酰氧化酶家族在多個器官纖維化過程中發揮重要作用[12，19-21]。

本文以BAPN抑制賴氨酰氧化酶，探索β-氨基丙腈在抑制子宮內膜纖維化中的作用以及最佳使用劑量。因此，我們以100 mg/kg/d劑量為實驗用最低劑量，并同時研究其二倍及三倍劑量在抑制子宮內膜纖維化中的作用效果，尋找最佳抑制大鼠子宮內膜纖維化的β-氨基丙腈用量。我們的研究結果表明大鼠子宮內膜損傷后使用不同劑量的賴氨酰氧化酶抑制劑β-氨基丙腈后，在各觀察時間點，大鼠子宮大體形態學都有改善，好于對照組，組織學觀察也發現用藥后子宮內膜恢復更好，腺體數量較對照組增加。Masson染色結果也表明用藥組的膠原含量較對照組低，而且以200 mg/kg劑量給藥效果最佳。同時，組織器官內的膠原主要包括可溶性與不可溶性膠原，其中不可溶性膠原在組織器官的纖維化形成中發揮重要作用，不可溶性膠原的過多沉積可引起組織器官纖維化形成。羥脯胺酸為膠原所特有，約占膠原蛋白的13.4%，測定羥脯胺酸的含量可以反映出膠原蛋白的含量。因此，我們定量檢測了正常組，實驗組及對照組大鼠子宮的不可溶性膠原的含量，結果表明實驗組的不可溶性膠原含量低于對照組，且以200 mg/kg β-氨基丙腈腹腔注射對大鼠子內膜不可溶性膠原纖維的抑制作用最佳，而300 mg/kg劑量組的不可溶性膠原與200 mg/kg劑量組無差異，但300 mg/kg劑量組盡管有改善子宮纖維化的作用，但給藥后大鼠子宮內膜較薄，腺體數量較少而且此劑量導致大鼠死亡率明顯上升，而且對膠原纖維的抑制作用并不優于200 mg/kg劑量組。以上結果說明β-氨基丙腈能夠較好抑制大鼠子宮內膜機械性損傷后導致的膠原沉積，減輕纖維化。

我們推測β-氨基丙腈用量過大可能會影響大鼠機體正常功能從而導致組織修復能力下降，治療效果差。因此我們認為β-氨基丙腈可以有效抑制Wistar大鼠子宮內膜纖維化，200 mg/kg給藥量對機械刮宮后大鼠子宮內膜纖維化的抑制效果最佳。同時我們的研究結果也表明LOX家族可能參與了機械損傷后大鼠子宮內膜的纖維化過程。這些發現為進一步研究賴氨酰氧化酶家族與宮腔粘連的相關性以及賴氨酰氧化酶家族在機械損傷后大鼠子宮內膜纖維化過程中的作用機制，為宮腔粘連的治療和發生機制的研究奠定了基礎，提供了新的研究思路和方向。

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