乳腺癌腫瘤干細胞體外培養體系的建立

許保海，崔熠，張瑤楠，3，郭永，3*，王乾興

(1.遵義醫學院細胞生物學教研室，遵義 563003；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081，3.國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室，北京 100081)

乳腺癌腫瘤干細胞是乳腺癌組織中極少數具自我更新和多向分化能力的細胞，該細胞具有化療、放療及低氧抵抗性，同時具有高致瘤性、高侵襲轉移性。乳腺癌干細胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑。傳統的體外研究腫瘤細胞是在二維條件下進行的，這種二維細胞培養方式比較方便，為大多數研究者所接受。但是傳統的二維平面培養體系采用單層細胞貼壁培養技術實現細胞體外的增殖，細胞的基因表達、信號轉導和形態學都與體內存在著差異[1]。三維培養與傳統的二維培養相比可以為細胞提供更類似于體內的三維空間環境和胞外基質環境，而且避免了體內實驗影響因素多、周期長的問題。在本研究中，我們擬以膠原作為原料的三維支架，建立一種可以避免細胞培養中心因為缺乏氧氣、營養而凋亡的乳腺癌三維培養體系。在此三維體系中，通過乳腺癌腫瘤干細胞在膠原材料上的形態學特征、增殖情況，以及乳腺癌腫瘤干細胞標志CD44+/CD24-/low的表達等方面評價，為深入探討乳腺癌腫瘤干細胞的發生發展以及三維培養為基礎的抗腫瘤藥物的藥敏試驗平臺提供技術保障。

資料與方法

一、實驗材料

1. 細胞系：乳腺癌細胞系MCF-7購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。MCF-7細胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。

2. 主要試劑：RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液(GIBCO，美國)；Rat CD44 Monoclonal Antibody(IM7) APC、Mouse CD24 Monoclonal Antibody(eBioSN3(SN3 A5-2H10)) PE、Mouse IgG1 kappa Isotype Control PE、Rat IgG2b kappa Isotype Control APC(Ebioscinece，美國)；三維培養支架材料由中科院遺傳與發育生物學研究所再生醫學研究組戴建武研究員贈予。

二、實驗方法

1.實驗分組：根據不同的培養方法分為兩組。二維細胞培養組：采用傳統二維細胞培養方法培養MCF-7細胞；三維細胞培養組：將MCF-7細胞接種于三維支架材料上培養。

2.細胞三維培養體系[2]：將乳腺癌細胞系MCF-7加入0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA溶液，37℃消化1 min，然后用培養基吹打，制備成單細胞懸液，1 000 rpm，離心5 min，棄掉上清，用培養基稀釋細胞到相應濃度。將細胞懸液滴加到預先處理好的三維支架材料上，37℃培養1 h，然后再加入細胞培養基，并在培養箱中靜置培養。靜置培養24 h后更換培養基，并將三維細胞材料轉移到培養箱中的小搖床上培養，搖床轉速控制在50～60 rpm，每天換一次培養基。

3.激光共聚焦顯微鏡(Confocal)觀察法：將培養有MCF-7細胞的三維培養材料取出，室溫下用PBS清洗3次，5 min/次，在避光的環境下加入200 μg/ml的熒光素雙醋酸酯(FDA)浸染1.5 min，避光用PBS清洗3次，5 min/次，放到蓋玻片上，在Confocal熒光顯微鏡(ZEISS LSM710，德國)下觀察。

4.細胞増殖實驗：將細胞進行消化、收集、重懸，使用96孔板每孔加入100 μl(含 3 000個細胞)，置于37℃、5%CO2培養箱中培養；24 h后每孔再加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續培育1 h；在450 nm波長測定各組各個復孔的吸光度(OD值)。平均值為各孔的校正吸光度值。培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

5.流式細胞術：先用胰酶消化MCF-7細胞，細胞計數后取5×106～1×107個細胞/ml，1 000 rpm，4℃離心10 min，棄上清；加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸??；1 000 rpm，4℃離心10 min，棄上清；PBS重復洗滌細胞兩次；將細胞重懸于100 μl結合緩沖液(Binding Buffer)，加入5 μl Rat CD44 Monoclonal Antibody APC抗體和0.3 μl Mouse CD24 Monoclonal Antibody PE輕輕混勻，4℃ 避光孵育 40 min，每10 min混勻一次；對照組為同性對照抗體Mouse IgG1 kappa Isotype Control PE、Rat IgG2b kappa Isotype Control APC。上述細胞均用PBS洗滌2次，離心，棄上清液，用300 μl PBS重懸，再流式細胞檢測儀上檢測。

三、統計學處理

結 果

一、三維培養乳腺癌腫瘤干細胞形態特性

將三維培養的MCF-7細胞，通過膠原酶消化1.5 h后，1 000 rpm離心5 min收獲細胞，將其再次二維培養，觀察其在二維條件下的細胞形態特性，并與二維條件培養的對照細胞進行比較，結果如下：在二維條件下，MCF-7細胞平展地粘附在塑料培養板上，呈多邊形、鋪路石樣的上皮細胞形態(圖1A)；將細胞接種到三維支架材料上培養7 d后，再次將細胞二維培養，細胞展現出三角形或者長梭形，還有很多不規則形態，部分細胞還伸展出長浸潤性偽足(圖1B)。

二、激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7在三維支架材料上的生長狀態

結果顯示，MCF-7細胞(綠色熒光，FDA染色)均勻地生長在三維支架材料上(圖2 A、B、C)。局部放大后發現，MCF-7細胞生長在三維支架材料上的細胞形態不同于二維培養的細胞形態，清晰可見長偽足，且細胞大小不均一，細胞形態多樣(圖2D)。

A： 二維培養MCF-7細胞；B：三維培養MCF-7細胞再次二維培養圖1 MCF-7細胞形態學觀察(×100)

A：綠色熒光(×100)；B：明場；C：Merge；D：綠色熒光(×630)圖2 MCF-7細胞在三維支架材料上的生長狀態

三、三維培養乳腺癌腫瘤干細胞增殖特性

體內實體腫瘤細胞具有持續增殖能力，而二維培養的腫瘤細胞出現接觸性抑制現象，與實體瘤細胞生命特征不相符。本實驗用CCK-8細胞增殖檢測法繪制生長曲線(圖3)。二維培養條件下，MCF-7細胞持續增殖到第3 天后進入平臺期，而三維培養后的細胞再次二維培養，細胞持續增殖到第4天進入平臺期，但三維培養后的細胞增殖速度與二維培養的細胞無顯著差異(P>0.05)。

四、流式細胞檢測乳腺癌干細胞相關亞群CD44+/CD24-/low的比例

分別對乳腺癌細胞系MCF-7二維培養及三維培養7 d后，通過流式細胞術檢測比較不同培養條件下腫瘤細胞群體中腫瘤干細胞所占比例。結果顯示，MCF-7細胞三維培養7 d后，CD44+/CD24-細胞所占比例增加，由38.9%增加至60.3%。結果提示，三維培養條件能提高乳腺癌干細胞CD44+/CD24-群體比例(圖4)。

圖3 CCK-8細胞增殖實驗

圖4 流式細胞儀檢測細胞CD44+/CD24-/low的含量

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均居全世界女性腫瘤首位，且乳腺癌發病率呈上升趨勢[3]。全球每年大約有20 萬患者死于乳腺癌的復發、轉移，大約占每年新發乳腺癌患者的20%[4]。傳統療法如放療和化療能夠消除腫瘤腫塊，但對少數具有惡性作用的腫瘤細胞仍然不能起到完全殺死的作用，這些惡性腫瘤細胞仍然能夠存活并自我更新，進一步發展為惡性腫瘤，這一類細胞就叫做腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)，在維持腫瘤生長、血管生成及促進腫瘤侵襲轉移中起決定性作用。到目前為止，已在白血病、膠質瘤、前列腺癌、胃癌和肝癌等惡性腫瘤中發現了腫瘤干細胞的存在[5-9]。

已有研究表明，乳腺癌中的確存在CSCs，CSCs表現出的自我更新、分化能力和放化療抵抗等干性特征是腫瘤復發或轉移的主要因素[10-11]。2003年Al-Hajj等[12]首次在乳腺癌標本中分離出乳腺癌干細胞，發現幾百個Lin-CD44+CD24-/lowESA+細胞在NOD/SCID小鼠中就可以形成腫瘤。2007年，Ginestier等[13]發現乳腺癌組織中高表達ALDH1的細胞也具有 CSCs特性。2011年，Golebiewska等[14]發現乳腺癌干細胞表現出可以明顯增加經過ABCG2(可導致藥物抵抗的主要因子)介導的Hoechst染色的“側群細胞”(SP)的數量。因此，利用乳腺癌干細胞的特征消除乳腺癌干細胞，為化療抵抗、轉移和復發的乳腺癌病人提供一個新的治療方法[15]，就需要我們深入研究乳腺癌干細胞的自我更新和分化演變的生物學機制。

目前，傳統的體外研究腫瘤細胞都是在二維環境下進行的，與體內微環境存在著差異，例如細胞增殖、細胞的基因表達、信號轉導和形態學等方面均存在差異。有研究發現，在食管癌細胞的三維培養中發現，二維培養的細胞并不表達Claudin-7，而在三維條件下，細胞卻高表達Claudin-7和Claudin-4，這種蛋白在體內的惡性腫瘤中是高表達的，與腫瘤細胞的遷移有直接關系。將口腔鱗癌上皮細胞接種到三維材料上培養一段時間，細胞不再是上皮樣形態，而是更接近成纖維樣，同體內轉移腫瘤分離的細胞類似[16]。因此，二維環境下培養的腫瘤細胞不能有效地模擬腫瘤細胞在體內的生存狀況。另外，體內進行的動物實驗研究周期較長，成本較高，而且由于體內多種因素的制約及體內和外界環境的相互影響往往使動物實驗結果變得復雜化。因此，無論是傳統的二維培養還是動物學實驗，在乳腺癌干細胞研究中都具有一定的局限性。

越來越多的研究者開始將三維培養用于臨床前藥物體外篩選、腫瘤干細胞維持和分化、信號異常轉導等腫瘤基礎領域的研究[17-19]。三維培養在少見惡性腫瘤的臨床前藥敏試驗和藥物篩選中尤為重要，可以有效避免不必要的臨床前實驗，從而減少病人資源和后續研究資金的浪費[20]。研究者們開發出了不同的三維培養模型來培養細胞，去模擬體內組織的微環境，為研究器官的發育以及疾病的治療提供了一個新的思路[21]。如將腫瘤細胞接種到人工合成材料PLGA三維支架上，可以研究腫瘤細胞的惡性特征與環境之間的關系[22]。而用殼聚糖-藻酸鹽制作的三維支架材料，能有效地在體外模擬神經膠質瘤[23]。一些水凝膠例如Matrigel、藻酸鹽和透明質酸也被用來制作三維支架材料，培養腫瘤細胞，研究腫瘤細胞的生命特征[24]。膠原是細胞外基質的主要組成部分，能為細胞的粘附和遷移提供粘連位點[25]。除此之外，膠原還有著很好的生物相容性、很低的免疫源性、較好的生物降解性、一定的機械強度[26]。這些特征說明膠原是一種優良的支架材料。傳統的方法是將膠原做成水凝膠的方式，培養腫瘤細胞，研究腫瘤細胞的生物學特性[27]。本次實驗所用原材料是膠原膜，主要成分為I型和Ⅲ型膠原，將膠原膜重新處理加工，得到膠原海綿支架[2]。它是一種多孔狀的三維支架網狀結構，孔徑大小為50～150 μm之間，這種多孔結構能為細胞的粘附和增殖提供足夠的三維空間。在本研究中，在二維條件下，MCF-7細胞平展的粘附在塑料培養板上，呈多邊形、鋪路石樣的上皮細胞形態，這種情況下細胞是單層生長，細胞和細胞之間的連接很少，僅僅存在于細胞間的接觸點。將細胞接種到三維支架材料上培養，在三維條件下，細胞展現出多邊形的或者球形的形態，還有很多不規則形態，部分細胞還伸展出長浸潤性偽足。這種浸潤性偽足的出現，可能與細胞獲得遷移和侵襲能力相關。另外，在三維上培養的腫瘤細胞，細胞核出現了多形性，中心區少量細胞出現凋亡，這些現象同體內實體腫瘤細胞的特性更為類似。CD44+/CD24-/low表型的細胞是乳腺癌干細胞相關亞群，也是CSCs的特征之一[28]。本實驗采用流式細胞技術對兩組的細胞分別進行了CD44+/CD24-/low表型細胞的比例的檢測。結果發現，三維培養條件下培養的MCF-7細胞，其CD44+/CD24-/low細胞的比例為60.3%，而二維的僅僅為38.9%，MCF-7細胞經三維培養后CD44+/CD24-/low細胞群的比例明顯增加，可初步認定以膠原為支架的三維培養體系能夠有效維持乳腺癌腫瘤干細胞干性。該模型可運用于探討乳腺癌腫瘤干細胞的發生發展的機制，以及三維培養為基礎的抗腫瘤藥物的藥敏試驗平臺。

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