Integrin β1和MMP-9在結直腸癌組織中的表達及其與臨床預后的關系

羅沖，張向東，吳艷林，王新偉

（河南省南陽市中心醫院 1.消化內科，2.腫瘤內科，3.普外科，河南 南陽 473009）

結直腸癌是一種常見的消化系統腫瘤，盡管大多數患者可及時進行相應的手術治療，但其淋巴轉移依然是術后復發以及影響患者生存的一個重要因素[1-2]，對結直腸癌轉移及其相關機制的研究具有重要的臨床意義。細胞的黏附反應作為腫瘤淋巴轉移及遠距臟器轉移的關鍵環節[3-5]，近年來成為研究者專注的重要課題之一。整合素（Integrins）是細胞黏附分子家族的重要一員，介導細胞與細胞外基質以及細胞與細胞之間的黏附反應，從而影響細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學特性[6-7]。整合素β1（Integrin β1）則是該家族最大的亞群，已被報道在多種腫瘤中異常表達，如頭頸部腫瘤、食管鱗癌、乳腺癌等[8-10]。基質金屬蛋白酶9（matrix metallopmteinase-9，MMP-9）則屬于基質金屬蛋白酶（MMPs）超家族中的明膠酶，可降解細胞外基質，廣泛參與腫瘤、炎癥、心血管系統等多種疾病的發生發展過程。研究發現[11-13]細胞外基質的降解是腫瘤侵襲轉移的基本步驟，包括胃癌、宮頸鱗癌、淋巴瘤腫瘤中出現MMPs家族的異常表達。但對于Integrin β1及MMP-9與結直腸癌臨床關系的系統性研究報道甚少。本文通過檢測結直腸癌組織中Integrin β1及MMP-9蛋白的分布和表達情況探討其與結直腸癌浸潤轉移及臨床分期的關系，分析其臨床意義，并于術后對患者進行隨訪，初步評價Integrin β1及MMP-9的表達與臨床療效之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年3月-2011年3月于南陽市中心醫院確診為結直腸癌的52例患者的病理標本及31例正常腸黏膜組織標本。所有入選病例均經患者知情同意且入院之前未接受過放、化療或手術治療。其中，男性37例，女性15例；年齡21～67歲，平均53歲；病程2～4年，平均2.6年。依據患者具體情況進行相應治療后保存患者的癌組織切片，同時詳細錄入其臨床病理資料，以備后續分析。另收集癌旁配對組織標本42例及31例非腸癌患者的正常腸黏膜組織標本作對照研究。

納入患者均在接受相應的治療之后參與隨訪調查，其中失訪2例。隨訪1年后死亡6例，隨訪3年后死亡14例，隨訪5年后死亡29例。其中27例死于腫瘤術后轉移、復發，2例死于其他疾病。

1.2 免疫組織化學鏈霉親和素過氧化物酶連接方法（Immunohistochemical SP）

將癌組織標本、癌旁配對組織標本及正常腸黏膜組織標本用10%甲醛浸泡固定，常規脫水及石蠟包埋后冷凍切片，免疫組織化學染色方法參照SP試劑盒（購自北京中杉金橋生物公司）的說明書進行操作。鼠抗人Integrin β1單克隆抗體及鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，磷酸鹽緩沖液PBS替代一抗作為陰性對照。

結果判定，Integrin β1和MMP-9均以細胞膜和/或胞質著棕黃色顆粒為陽性[7]。參考文獻[8]的半定量方法評定染色結果，即根據陽性細胞的數量和染色強度進行計分：①染色強度的記分標準，不著色記0分、輕度著色（略強于陰性對照，表現為淡黃色顆粒）記1分、中度著色記2分、重度著色記3分；②陽性細胞數量的記分標準，＜10%的細胞著色記1分、10%～50%的細胞著色記2分、＞50%的細胞著色記3分。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料行χ2檢驗或校正χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法，檢驗水準α=0.0167，相關性分析采用Spearman等級相關分析，采用乘積極限法（Kaplan-Meier Method）分析生存率，采用Logrank法檢驗生存分析差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Integrin β1和MMP-9蛋白在結直腸癌組織中表達

免疫組織化學SP法染色結果顯示在結直腸癌組織、癌旁組織以及正常腸黏膜組織的細胞膜和/或胞質中均可見黃色著色顆粒（見圖1），說明Integrin β1和MMP-9在結直腸癌組織、癌旁組織及正常腸黏膜組織中均有表達。Integrin β1蛋白在結直腸癌組織、癌旁組織和正常腸黏膜組織中的陽性表達率分別為82.69%、14.29%及6.45%，差異有統計學意義（P＜0.05）；MMP-9在結直腸癌組織、癌旁組織及正常腸黏膜組織中的陽性表達率分別為80.77%、16.67%及9.68%，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表 1）。Integrin β1和MMP-9蛋白在結直腸癌組織中表達水平與臨床病理指標間的關系經進一步統計學分析顯示，Integrin β1和MMP-9蛋白的表達與肝轉移和Dukes分期相關（P＜0.05）（見表 2）。

2.2 Integrin β1和MMP-9蛋白表達與術后生存時間的關系

本實驗隨訪期限為5年，其中失訪2例。在結直腸癌組織中，Integrin β1表達陽性組的平均生存時間為（32.34±1.93）個月，Integrin β1表達陰性組的平均生存時間為（53.5±1.3）個月，兩組比較差異有統計學意義（P=0.001）（見圖2）。MMP-9表達陽性組的平均生存時間為（30.05±2.17）個月，MMP-9表達陰性組的平均生存時間為（49.31±1.19）個月，兩組比較差異有統計學意義（P=0.004）（見圖3）。

2.3 Integrin β1和MMP-9蛋白表達與術后復發的關系

對52例患者進行隨訪的過程中，失訪2例，2例死于其他疾病，48例納入考察。發現有27例患者術后出現復發，其中5例再次進行手術。術后復發情況與Integrin β1和MMP-9 2種蛋白表達水平的關系見表3，Integrin β1表達陽性組的復發率高于陰性組，MMP-9表達陽性組的復發率同樣高于陰性組。

2.4 Integrin β1和MMP-9蛋白表達的相關性分析

Integrin β1和MMP-9 2種蛋白的表達呈正相關（r=0.981，P=0.001）。見表 4。

圖1 Integrin β1和MMP-9蛋白表達結果 （免疫組織化學SP法染色×400）

表1 Integrin β1和MMP-9蛋白表達

表2 Integrin β1和MMP-9蛋白表達和結直腸癌患者臨床病理特點的關系

圖2 結直腸癌組織中Integrin β1對患者術后生存時間的影響

圖3 結直腸癌組織中MMP-9對患者術后生存時間的影響

表3 結直腸癌術后復發與Integrin β1和MMP-9表達水平的關系

表4 Integrin β1和MMP-9蛋白表達的相關性

3 討論

惡性腫瘤的一個重要生物學特性即是其極強的侵襲遷移能力，該能力不僅關系著患者的臨床治療效果及預后，還是患者術后復發及生存率下降的主要原因。結直腸癌作為一種常見的消化系統腫瘤，其侵襲遷移過程也是研究者們關注的重點之一。結直腸癌的遠距臟器轉移及侵襲是一個多因素共同參與的復雜過程，其中細胞的黏附是一個重要的環節。本研究通過對52例結直腸癌患者的病理標本、42例癌旁組織標本及31例非腸癌患者正常腸黏膜組織標本的對照研究，分析與細胞黏附密切相關的2個因子Integrin β1和MMP-9在結直腸癌中的表達情況。

免疫組織化學染色結果顯示，Integrin β1和MMP-9蛋白在結直腸癌患者的病理組織中表達高于癌旁組織及正常腸黏膜組織，證實Integrin β1和MMP-9蛋白的表達與腫瘤的發生有密切的關系。同時對患者的臨床病理資料進行統計學分析，結果顯示Integrin β1和MMP-9的表達與結直腸癌的肝轉移和Dukes分期相關。Integrin β1蛋白的表達對判斷結直腸癌的病理進程和分期具有重要的參考意義，Integrin β1和MMP-9可作為新的衡量結直腸癌病理進程及轉移的分子標記物。

此外本研究還分析了患者的5年生存情況及術后復發情況與這2種蛋白之間的關系。結果發現，Integrin β1和MMP-9陽性表達組的患者術后復發率高于陰性組，且5年術后生存時間明顯縮短，不利于患者預后。MMP-9屬于基質MMPs超家族的一員，大量的研究均證實MMPs表達增強或活性增加可導致結直腸癌的不良預后[14-15]，與本研究結果具有一致性。MMP-9的表達受多種調節因子的影響，有研究表明[16]，整合素家族中Integrin αvβ3可促進腫瘤細胞的分泌，誘導MMPs的激活，參與腫瘤的侵襲遷移。本研究分析結直腸癌中Integrin β1和MMP-9蛋白表達的相關性，結果顯示兩者的表達呈正相關，提示Integrin β1和MMP-9在結直腸癌的侵襲轉移中具有協同作用，但是兩者參與調控腫瘤轉移的具體作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，Integrin β1及MMP-9在結直腸癌組織中表達升高，兩者皆與結直腸癌的病理特征和腫瘤的侵襲轉移密切相關，同時影響結直腸癌患者的術后復發及生存，此外在結直腸癌發病的過程中兩者的高表達可能具有協同作用，所以Integrin β1及MMP-9可以作為今后治療和預后結直腸癌的新靶點。

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