血清CGB和GnRH1 mRNA表達與妊娠滋養細胞腫瘤血行轉移的相關性研究

李莉，李濤

（西南醫科大學附屬醫院 腫瘤科，四川 瀘州 646000）

妊娠滋養細胞疾病（gestational trophoblastic disease，GTD）是一組來源于胚胎滋養細胞的疾病，根據組織學將其分為葡萄胎（hydatidiform mole，HM）、侵蝕性葡萄胎（invasive mole，IM）、妊娠性絨毛膜癌（gestational choriocarcinoma，GCC）及胎盤部位滋養細胞腫瘤[1]。而侵蝕性葡萄胎、妊娠性絨毛膜癌和胎盤部位滋養細胞腫瘤又統稱為妊娠滋養細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）。GTN可繼發于葡萄胎、流產、異位妊娠及足月產等，其中約60%來源于葡萄胎[2]。一些腫瘤細胞擁有能力穿透血管壁，在血液中循環，達到身體的其他領域。這些循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是血行轉移和腫瘤進展的重要原因之一[3]。因此檢測患者外周血循環腫瘤細胞可能對評估GTN早期血行轉移、檢測治療和預后起重要作用。

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是由α和β 2條多肽鏈通過非共價鍵結合，β亞基決定其免疫特性[4]，人絨毛膜促性腺激素β亞基（human chorionic gonadotropin beta subunit，CGB）作為妊娠滋養細胞腫瘤標志物之一，長期被用于GTN的診斷、療效評估和隨訪。人類促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）是由下丘腦分泌的十肽激素，在性成熟和生殖繁育能力方面起重要作用。人體中存在2種亞型GnRH1和GnRH2，在卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌和前列腺癌中GnRH1表達水平升高[5]，并且已證明GnRH1的受體激動劑可以抑制卵巢癌和子宮內膜癌的增殖，促進細胞凋亡[6]。有研究表明在子宮內膜癌和子宮內膜非典型增生時CGB的表達增加同時伴有GnRH1表達增加[7]。

本研究通過采用逆轉錄聚合酶鏈反應（transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測GTN患者血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況，探討其表達與腫瘤轉移的相互關系，尋找診斷GTN患者早期血行轉移的可能標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2015年6月西南醫科大學附屬醫院、四川省遂寧市射洪縣人民醫院和四川省腫瘤醫院3所醫院腫瘤科門診確診的GTN患者52例（GTN組）和HM患者21例（HM組），同期體檢正常妊娠婦女20例（正常妊娠組）和非妊娠婦女20例（非妊娠組）的基本臨床資料及外周血5 ml。52例GTN患者，年齡16～42歲，平均（29.7±0.31）歲；末次妊娠為葡萄胎者41例（78.8%），流產9例（17.3%），異位妊娠1例（1.9%），足月產1例（1.9%）。

1.1.1 GTN組 納入標準：①初診的妊娠性絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎或中間型滋養細胞腫瘤患者；②經B超、影像學或病理學診斷確診。排除標準：①已接受藥物或手術治療的GTN患者；②不能配合研究抽取外周血的患者；③非妊娠性絨毛膜癌患者；④其他腫瘤病史者。

1.1.2 HM組 納入標準：初診經B超、影像學或病理學確診的葡萄胎患者。排除標準：已接受過藥物或手術治療；其他腫瘤病史者。

1.1.3 正常妊娠組 納入標準：經血β-HCG和B超確診的孕8～12周正常妊娠婦女。排除標準：既往有葡萄胎病史；既往有其他腫瘤病史。

1.2 GTN的診斷及FIGO分期

根據患者妊娠后（包括葡萄胎組織排空以后或流產、異位妊娠及足月產后）出現的相應癥狀和體征（如陰道流血，肺轉移等），結合患者的血清HCG水平，GTN的診斷可以確定，影像學和組織學檢測對診斷是非必須的。FIGO分期：所有患者依據國際婦產科協會（the International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）2002年頒布的新的標準進行分期及預后評分[8-9]，0～6分為低危，≥7分為高危。

1.3 總RNA提取及RT-PCR

RNA提取試劑盒RNAfast 200購自上海飛捷生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒[Prime Script? RT reagent Kit（Perfect Real Time）]及 real-time PCR 試劑盒[SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）]均購自寶生物工程（大連）有限公司。CGB引物（正向5'-AGCCAAAGACCGCTACG-3'；反向5'-TG AGGGGACAAGCTACCG-3’），GnRH1引物（正向5'-GACCTGAAAGGACTCTGGA-3'；反向 5'-CTTCTGGCC CAATGGATTTA-3'）[10]均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。按RNAfast 200說明書分別提取血液中總RNA，經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280者為合格樣品。取500 ng總RNA為模板，按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系，RNA水平使用2-??Ct方法相對定量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料符合正態分布采用均數±標準差（±s）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較使用q檢驗，計數資料采用例表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GTN組、HM組、正常妊娠組及非妊娠組血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況

各組CGB mRNA、GnRH1 mRNA RT-PCR典型條帶圖見圖1、2。20例非妊娠組血清中CGB mRNA陰性，GnRH1 mRNA表達較少；20例正常妊娠組CGB mRNA和GAPDH mRNA 較少量表達；21例HM組和52例GTN組CGB mRNA和GAPDH mRNA表達均有所升高。4組患者血清CGB mRNA表達水平差異有統計學意義（H=9.748，P=0.005），說明4組血液中CGB mRNA表達水平不同，GTN組血清中CGB mRNA水平高于其余3組。4組血清GnRH1 mRNA表達水平差異有統計學意義（H=6.522，P=0.018），說明4組血液中GnRH1 mRNA表達水平不同，GTN組血清中GnRH1 mRNA水平升高，見表1。

2.2 GTN組血清CGB mRNA表達與臨床指標的關系

根據臨床指標中年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、遠處轉移、轉移灶數目、臨床分期、預后評分等因素分組。分別比較不同組中血清CGB mRNA表達情況。其中CGB mRNA表達與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小無關（P＞0.05）；與遠處轉移、轉移灶數目、臨床分期、FIGO預后相關（P＜0.05）。見表2。

2.3 GTN組血清GnRH1 mRNA表達與臨床指標的關系

根據臨床指標中年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、遠處轉移、轉移灶數目、臨床分期、預后評分等因素分組。分別比較不同分組中血清GnRH1 mRNA表達情況。其中GnRH1 mRNA表達與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、轉移灶數目無關（P＞0.05）；與遠處轉移、臨床分期、FIGO預后相關（P＜0.05）。見表3。

圖1 GnRH1 mRNA RT-PCR條帶圖

圖2 CGB mRNA RT-PCR條帶圖

表1 各組血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況

表2 GTN組血清CGB mRNA表達與臨床指標的關系

3 討論

GTN是胚胎的滋養細胞發生惡變而形成的腫瘤，包括中間型滋養細胞腫瘤、侵蝕性葡萄胎和妊娠性絨毛膜癌。妊娠滋養細胞腫瘤患者死亡的重要原因多數是發生遠處轉移，如肺轉移、肝轉移、腦轉移等。一些腫瘤細胞擁有能力穿透血管壁，在血液中循環，到達身體的其他領域。CTC反映了腫瘤的侵犯，因此早期發現血液中的CTC，對于患者預后判斷、療效評價和個體化治療都有著重要的指導作用。GTN是胚胎的滋養細胞發生惡變，因此外周血中檢測惡變的細胞滋養細胞和合體滋養細胞，有助于早期發現腫瘤血行轉移。目前，直接檢測腫瘤細胞技術較為復雜，檢測周期較長，臨床推廣困難，因此檢測外周血中循環腫瘤細胞的重要任務是尋找其特異性標志物。國外對于檢測妊娠滋養細胞腫瘤外周血循環腫瘤細胞的相關研究報道較多，而針對國人的報道則較少[11-12]，本研究納入4組不同人群，收集臨床資料和外周血，使用RTPCR檢測各組患者血清CGB和GnRH1 mRNA表達情況，分析其與妊娠滋養細胞腫瘤早期轉移等臨床參數的關系，探究其與妊娠滋養細胞腫瘤血行轉移的相互關系。

表3 GTN組血清GnRH1 mRNA表達與臨床指標的關系

CGB是有胎盤合體滋養細胞分泌的一種糖蛋白。本研究顯示非妊娠組外周血中無CGB mRNA表達，GTN組外周血中CGB mRNA表達水平高于HM組、正常妊娠組。GTN組外周血中GnRH1 mRNA表達水平高于HM組、正常妊娠組和非妊娠組。提示CGB和GnRH1表達可能作為妊娠滋養細胞腫瘤檢測的標志物之一。

本研究顯示，GTN組外周血CGB mRNA 表達陽性與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小無關；與遠處轉移、轉移灶數目、臨床分期、FIGO預后相關。GnRH1 mRNA表達陽性與年齡、前次妊娠、最大腫瘤大小、轉移灶數目無關；與遠處轉移、臨床分期和FIGO預后相關。CGB mRNA和GnRH1 mRNA表達陽性有遠處轉移組患者高于無遠處轉移組，臨床分期Ⅲ組高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ組，FIGO高危組高于FIGO低危組，這些均提示外周血CGB mRNA和GnRH1 mRNA表達與轉移相關臨床指標相關，因此CGB和GnRH1可能成為評估妊娠滋養細胞腫瘤早期血行轉移的有效評價指標。

參 考 文 獻：

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