草魚養殖池噬菌蛭弧菌的分離與鑒定

陳煜安

摘要：利用雙層平板法，以嗜水氣胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌，從草魚養殖池水中分離蛭弧菌一株；根據蛭弧菌hit基因序列設計引物進行PCR擴增，所得產物經膠回收、測序比對，發現其序列與噬菌蛭弧菌的hit基因100%同源，表明本研究所分離得到的為噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）。

關鍵詞：蛭弧菌；噬菌蛭弧菌；分離；鑒定；PCR

噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus），是一類由Stolp和Petzold于1962年首次發現的、原核生物界唯一一類周質型專性捕食性細菌。其體形小，在土壤、淡海水、污水等不同環境中分布廣泛，且運動活潑，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物學特性。

養殖概論

近年來，隨著集約化水產養殖業的進一步發展，以及養殖水體的污染，嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性病原菌對草魚等水產養殖動物造成了嚴重的危害。蛭弧菌能寄生和裂解大多數種類的革蘭陰性菌。鑒于這一特性，噬菌蛭弧菌受到了國內外學者的廣泛關注，逐漸成為水產養殖業中一種良好的微生態制劑，在農業、工業和醫學等不同領域均顯示出了廣闊的應用前景。

本研究利用雙層平板法從草魚養殖池水中分離得到蛭弧菌一株，根據噬菌斑形成等對其進行初步的鑒定，同時根據蛭弧菌的host interaction（hit）基因序列設計了特異性引物，從分子水平上對該菌株進行了鑒定，確定該菌為噬菌蛭弧菌。為該菌應用于水產養殖疾病防治等理論研究與實踐應用提供了基礎資料。

材料與方法

水樣 采自紹興皋埠鎮某草魚養殖池，用采水器從底部取水，裝于50mL滅菌的離心管中。

宿主菌株 以本實驗室分離自患病草魚并保存的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌。

培養基 ①雙層培養基：上層為0.6%自來水瓊脂，用于蛭弧菌篩選、分離和純化；下層為1.5%自來水瓊脂；②普通營養肉湯培養基（NB）；③浸出液：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉15g，蒸餾水加至1000mL，pH7.0。

主要試劑 Taq酶、dNTPs購自上海生工產品；DNA回收試劑盒購自愛思進；pGMT載體、大腸桿菌感受態等均購自天根公司；其他為國產分析純。

噬菌蛭弧菌的分離與鑒定 第一，宿主菌懸液的制備。將宿主菌嗜水氣單胞菌接種于NB平板上，30℃過夜培養，刮取、無菌水洗脫細菌并收集于5mL離心管中，10000g，室溫離心2min，去上清液，加入3mL無菌水制備成懸液，4℃保存備用。

第二，蛭弧菌的分離與純化。①樣品處理：取池水，經八疊紗布過濾，將澄清液置超速冷凍離心機中離心（4℃，30000g，40min）；沉淀用5mL無菌水溶解，再經0.22μm濾膜過濾后備用；②蛭弧菌的分離、純化：取1mL濾液加入2mL的宿主菌懸液，混勻；然后加入7mL滅菌并保持在48℃左右的0.6%自來水瓊脂培養基，搖勻后倒至經滅菌的1.5%自來水瓊脂固體培養基上。30℃下倒置培養，觀察噬菌斑的形成；經2至4d的培養后，挖取平板上透明、圓形和整齊的單個噬菌斑，置于NB液體培養基的離心管中，浸泡10min以上；用浸出液做雙層平板，重復傳代3次以上獲得純化的蛭弧菌。

第三，蛭弧菌的PCR鑒定。在結合以上噬菌斑進行鑒定的基礎上，根據相關知識及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列，利用Oligo 6.5軟件設計了特異性引物：BDhitf：5'-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3，BDhitr：5'-ACGACTGTGAACGGCAACG-3。PCR擴增體系為：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0μL，Taq酶0.2μL，dNTPs 0.4μL，10×PCR緩沖液2.5μL，引物各1.0μL，水17.9μL。循環參數為：95℃預變性4min；94℃變性40sec，56℃退火25sec，72℃延伸1min，35個循環；72℃再延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果，PCR產物經割膠回收后，與T載體連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；陽性克隆經鑒定后送上海生工測序，用blast和ClustalW2軟件進行序列比對分析。

結果與分析

蛭弧菌的分離結果 采用雙層瓊脂平板法，以嗜水氣單胞菌為宿主菌，通過濾膜過濾的方法收集草魚養殖池水池培養蛭弧菌。結果發現，從第2d起開始形成大小相似、直徑約0.1至0.25cm的圓形、透明、邊緣整齊、凹陷的噬菌斑“負菌落”；3d后出斑率較高，直至7d左右，其大小總體上隨培養時間延長而增大，顯示所分離的蛭弧菌具有明顯的噬菌作用。挑選特征典型的噬菌斑進行傳代，經4次傳代后得到蛭弧菌一株，記為BD-sx1（圖1）。

蛭弧菌的PCR鑒定 在利用噬菌斑等形態學指標和噬菌特性對本研究過分離到的蛭弧菌進行初步觀察與鑒定的基礎上，本研究根據文獻報道及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列設計了特異性引物，以宿主嗜水氣單胞菌和大腸桿菌DH5α為陰性對照，進行了PCR擴增反應。結果顯示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中獲得了近800 bp的擴增條帶，大小與預期相符（圖2）。進而，本研究對PCR擴增產物進行了割膠回收，純化產物與T載體連接后，轉化感受態大腸桿菌DH5α感受態細胞，對經鑒定后的陽性克隆進行測序，測序結果blast和Clustal W2軟件與GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列進行比對了分析。比對結果表明，所得基因序列與噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（圖3），進一步證明本研究所分離、純化到的蛭弧菌菌株BD-sx1為噬菌蛭弧菌（B.bacteriovorus）。

討論

培養基及其濃度 培養基的營養成分與宿主菌、蛭弧菌以及其他雜菌的生長密切相關。Stolp等在1963年就提出經稀釋的低營養培養基不利于宿主菌的生長而有利于蛭弧菌的生長。因此，在分離、純化蛭弧菌時應使用低營養成分的培養基。Staples等比較了不同濃度稀釋度的培養基從水樣中分離蛭弧菌的效果，結果發現高度稀釋的培養基分離效果最佳。司稚東等研究發現，在1/10胨肉膏和酵母膏培養基上可形成蛭弧菌噬菌斑，但同時雜菌生長更快、菌落多，蛭弧菌噬菌斑易被其遮蓋；而2%的自來水瓊脂培養基上雜菌少、噬菌斑明顯、清晰，更適于分離蛭弧菌。本研究分離純化結果也顯示，用低營養成分的自來水瓊脂培養基分離蛭弧菌效果較好；同時，與司稚東等相比，瓊脂使用濃度更低，僅用1.5%的瓊脂也可取得良好分離效果。

雙層瓊脂平板法是蛭弧菌分離的經典方法，但在使用該方法時應注意上層培養基的溫度應該控制在45-48℃左右，同時掌握好倒平板的時機。溫度過高，宿主菌和水樣中待分離的蛭弧菌可能會被燙死；溫度過低，上層培養基易凝固，容易導致倒出的平板不平整，宿主菌和蛭弧菌難以均勻分布，最終導致噬菌不清晰，影響分離效果。

蛭弧菌的鑒定 傳統的蛭弧菌的鑒定可根據噬菌斑形態、革蘭氏染色、接觸酶抑制、寄生性、菌體形態的顯微觀察等方法來進行，但上述方法存在特異性差、易受宿主菌干擾、有些較為繁瑣等缺點，且容易產生誤判。而本研究根據蛭弧菌hit基因序列設計特異性引物進行PCR擴增，并結合測序比對和生物信息學鑒定，具有快速、準確等優點，與傳統的噬菌斑形態觀察、寄生性、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等相結合，可從不同角度、不同層次進行蛭弧菌的鑒定，利用分子鑒定提高準確性，以更好地滿足理論研究與實踐應用的需要。

蛭弧菌微生態制劑在草魚等水產養殖業中的應用前景 草魚是我國的大宗魚類、當家品種之一，但草魚等“四大家魚”的病害頻發。傳統的抗生素和化學藥物治療已難以適應國內外消費者對綠色無公害水產品質量安全的要求，因此，發展蛭弧菌等微生態制劑是符合可持續發展和環境要求的重要發展方向。鑒于蛭弧菌株獨特的“寄生”和“裂解（溶菌）”病原菌的生物學特性，作為一種益生菌，蛭弧菌微生態制劑取代抗生素藥物用于草魚等水產養殖業具有獨特的優勢和廣闊的發展前景。

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（作者單位：浙江省紹興市柯橋區魯迅中學）