槲皮素對氧化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞炎癥反應的影響

李海禹，孟哲，王琛，師強偉

（鄭州大學第一附屬醫院心內科，河南 鄭州 450000）

動脈管壁內的長期慢性炎癥反應是促進粥樣硬化的疾病發展過程的重要致病因素之一[1]。Toll受體家族（TLRs）是一組病原分子模式識別受體，與內毒素（LPS）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和熱休克蛋白等內源性及外源性致炎物質結合，通過激活核轉錄因子（NF）-κB等核內轉錄因子上調單核細胞趨化蛋白（MCP）-1和腫瘤壞死因子（TNF）-α等多種炎癥因子的表達，從而促進炎癥反應過程。Toll受體4（TLR4）是被廣泛關注的TLRs成員之一，在調節天然免疫和觸發炎癥級聯反應方面具有舉足輕重的作用[2]。研究表明[3]：抑制TLR4的過度激活可能是冠心病藥物治療的靶點。同時，槲皮素具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等多種生物活性作用。本實驗旨在觀察：槲皮素對抑制ox-LDL誘導的血管平滑肌的炎癥反應的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM高糖培養液（美國Gibco公司）；胎牛血清及real-time RT-PCR試劑盒（北京TransGen公司）；ox-LDL購于廣東頤圓生物有限公司；槲皮素、青霉素、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）、鏈霉素和噻唑藍（MTT）（美國sigma公司）；MCP-1和TNF-α酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國R&D systems公司）；兔抗大鼠TLR4、髓樣分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）、anti-TLR4及β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 細胞培養及處理

分離8～10周SD大鼠胸主動脈，仔細剝離血管內膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，使用貼壁法培養。將細胞置于含12%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，其中含有100 U/mL濃度的青霉素和100 μg/mL濃度的鏈霉素，然后放入37℃、5% CO2細胞培養箱中。待細胞融合至80%～90%時，用于以下實驗。

1.3 實驗分組

將細胞分為5組：A組（對照組）、B組（ox-LDL干預組）、C組（ox-LDL＋槲皮素50 μmol/L）、D組（ox-LDL＋ 槲 皮 素100 μmol/L） 和 E組（ox-LDL＋ 槲 皮 素200 μmol/L）。B～D組中ox-LDL的濃度均為100 μg/mL。

1.4 方法

1.4.1 將細胞按4×104/孔的密度接種于96孔板，按照前述細胞培養條件培養24 h備用，①應用MTT比色法測定不同濃度槲皮素的細胞毒性時，改用2%低血清培養基培養12 h后， 給予不同濃度槲皮素和ox-LDL（100 μg/mL）濃度干預24 h。吸去培養液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，棄去上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，微微振蕩數次后，在全自動酶標儀上于570 nm處測定各組吸光值。②應用ELISA測定上清液中TNF-α和IL-1β的分泌時，換用無血清培養基孵育12 h。不同濃度槲皮素或anti-TLR4抗體及PDTC預處理1 h，再使用ox-LDL（100 μg/mL）刺激不同時間后，收集各組細胞上清液。依據操作說明，使用ELISA試劑盒測定MCP-1和TNF-α的分泌。使用自動酶聯免疫吸附儀在450 nm處讀取數值，繪制MCP-1和TNF-α的標準曲線，并依據此計算各實驗組結果。

1.4.2 將各組細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，加入含血清培養基，待細胞密度達到80%～90%融合時備用。①應用實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）測定TLR4和Myd88 mRNA表達時改用無血清培養基孵育12 h。換用不同濃度槲皮素預處理1 h，再給與100 μg/mL的ox-LDL刺激6 h，按照說明書使用Trizol（北京Transgen公司）提取各組總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，分光光度計在260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉錄試劑盒（北京Transgen公司）操作步驟，將各組mRNA反轉錄為cDNA。使用Bio-Rad IQ5熒光PCR儀自帶分析軟件對real-time PCR結果進行分析。②應用Western-blot檢測TLR4、Myd88和NF-κB（p65）蛋白表達時，改用無血清培養基孵育12 h。換用含不同濃度槲皮素無血清培養基孵育 1 h后，加入 ox-LDL（100 μg/mL）刺激 24 h。每孔使用200 μL RIPA裂解液提取蛋白。核內NF-κB（p65）蛋白使用核蛋白提取試劑盒提取。BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠進行電泳，半干轉膜儀轉膜。一抗濃 度 為 ：TLR4（1 ∶ 200）、Myd88（1 ∶ 400）、NF-κB（p65）（1∶ 500）和 β-actin（1∶ 2000）。以 β-actin作為內參照。化學發光法檢測，圖像采集，Quantity one軟件進行圖像分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度槲皮素細胞毒性測定

使用MTT法對不同濃度槲皮素干預的各組細胞進行測定后，在0～200 μmol/L濃度范圍內，槲皮素均未顯示明顯的細胞毒性；僅給予細胞100 μg/mL ox-LDL孵育24 h后，也未出現明顯細胞毒性。因此，在后續的試驗中，選取50，100，200 μmol/L 3個濃度進行干預處理。結果如圖1所示。

2.2 槲皮素對ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞（VSMCs）MCP-1和TNF-α分泌的影響

ELISA結果顯示：在給予細胞100 μg/mL ox-LDL刺激不同時間后，MCP-1和TNF-α的分泌明顯上升，最高可達：1027.45 pg/mL和651.74 pg/mL。使用槲皮素預處理1 h后，可以有效減少MCP-1和TNF-α的分泌，最低可達：448.27 pg/mL和258.16 pg/mL，并呈現時間和劑量依賴性，如圖2所示。

2.3 槲皮素對ox-LDL誘導的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的影響

Western-blot結果顯示：使用100 μg/mL ox-LDL對VSMCs刺激24 h后，TLR4、Myd88和核內NF-κB（p65）的表達明顯升高。槲皮素對細胞進行預處理1 h后，明顯抑制ox-LDL誘導的TLR4和Myd88的高表達及NF-κB（p65）的核轉位，并具有濃度依賴性。在mRNA水平上，槲皮素顯著降低TLR4和Myd88基因的轉錄水平。提示：槲皮素能夠有效的抑制TLR4信號通路的激活。結果如圖3所示。

2.4 抑制劑對ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α分泌的影響

為了進一步明確槲皮素對ox-LDL誘導的VSMCs炎癥抑制作用是否部分依賴于TLR4信號通路，先使用anti-TLR4抗體和NF-κB（p65）特異性抑制劑PDTC對細胞進行預處理1 h，再給予ox-LDL刺激6 h或24 h。ELISA結 果 提 示 ：anti-TLR4抗 體 和PDTC均能夠顯著抑制ox-LDL誘導的MCP-1和TNF-α高表達，起到了與槲皮素相似的作用。以上結果提示：TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信號通路的激活可能參與了ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應過程。結果如圖4所示。

圖2 槲皮素抑制ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

圖3 槲皮素抑制ox-LDL誘導的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB (p65)信號通路的激活

圖4 抑制劑減少ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

3 討論

近年來，研究發現病理性的炎癥反應通過加速泡沫細胞堆積、VSMCs凋亡及纖維帽降解等方式，不僅增加斑塊的形成速度，同時也使已存在的穩定性斑塊向易損性斑塊轉變，極大地影響著疾病的轉歸[4]。氧化應激是斑塊內部炎癥反應的重要特征之一。在斑塊形成的初始階段，低密度脂蛋白（LDL）首先聚集于斑塊中央部位，隨后經過一系列復雜的氧化修飾過程最終成為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）[5]。Ox-LDL通過刺激巨噬細胞、內皮細胞和VSMCs釋放多種炎癥因子和趨化因子，促進了斑塊的形成和失穩[6]。因此，ox-LDL被認為是一個強有力的致炎因子。

當與內毒素（LPS）、ox-LDL和AngII等內源性及外源性配體結合后，TLR4通過自身活化，將細胞外信號經由Myd88傳導，進而引發NF-κB（p65）核轉位，誘發靶向炎癥因子轉錄水平升高[7]。在本實驗中發現：ox-LDL能夠誘導VSMCs的炎癥因子過分泌，同時伴隨TLR4、Myd88表達升高及NF-κB（p65）核轉位增加，表明ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應可能依賴于TLR4介導的炎癥通路的激活。槲皮素能夠有效抑制ox-LDL誘導的VSMCs MCP-1和TNF-α過分泌，并具有濃度和時間依賴性，顯示出較強的抗炎作用[8]。同時，槲皮素可減少TLR4、Myd88的表達及NF-κB核轉位，抑制TLR4介導的炎癥通路的激活[9]。在使用anti-TLR4抗體及PDTC對TLR4和NF-κB進行特異性抑制后，也可以起到與槲皮素相似的抗炎作用。

以上結果提示：槲皮素可以有效地抑制ox-LDL誘導的VSMCs炎癥反應，其抗炎作用可能依賴于對TLR4介導的炎癥通路的調節。這為槲皮素用于粥樣硬化性疾病的治療提供了一定的分子學基礎。

參考文獻

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