對氧磷酶1基因多態性與乳腺癌的相關性研究

傅春燕 程雪 潘穎 陳述政 徐民

乳腺癌是全球第二大常見癌癥，也是女性最常見的癌癥和死亡原因之一[1-2]。研究顯示老齡化、癌癥家族史、不良飲食習慣等都是乳腺癌的風險因素[3-5]。內源性代謝物和外源性致癌物質可引起遺傳損傷[6]，致癌基因和腫瘤抑制基因突變[7]最終可能導致乳腺癌的發生。此外，在乳腺癌的發生、發展過程中，氧化應激可能對細胞增殖和惡性轉化起促進作用[8]。位于染色體7q21.3上的對氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）不僅能夠降低氧化應激反應，還與多種癌癥的發生、發展有關。Wu等[9]認為PON1多態性可能與乳腺癌的發生風險有關。PON1表達和基因型分布在不同人群中差異很大[10]。PON1基因的編碼區存在兩種常見的功能性單核苷酸多態性，分別是L55M和Q192R位點基因多態性[10-11]。PON1低活性一直是胃癌[12]、系統性紅斑狼瘡[13]和心血管疾病[14]等的風險因素。此外，一些研究表明PON1基因L55M和/或Q192R位點基因多態性與上皮性卵巢癌、肺癌等的風險增加相關[15]。本研究探討PON1基因L55M和Q192R位點基因多態性與患乳腺癌風險之間的相關性，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2010年1月至2015年4月本院乳腺甲狀腺外科收治的260例乳腺癌患者作為研究組，另外選同期260例健康婦女作為對照組。經過組織病理學確診，年齡＞18歲，診斷標準參照《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2013版）》[16]，并使用美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期系統[17]來確定乳腺癌患者的發展階段，納入患者治療前卡氏（KPS）評分＞80分，心電圖與心臟功能正常。健康婦女均無任何與PON1基因L55M和Q192R位點基因多態性相關的惡性腫瘤或其他疾病的病史。研究組患者AJCCⅠ期13例，Ⅱ期81例，Ⅲ期126例，Ⅳ期40例；淋巴結N0期 115例，N1期145例；雌激素受體（ER）陽性75例，陰性185例；孕激素受體（PgR）陽性83例，陰性177例。兩組年齡、BMI、絕經狀態、懷孕史、吸煙和飲酒情況等比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；但研究組患者有乳腺癌家族史的比例顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

1.2 方法 收集所有受試者的信息，包括年齡、BMI、絕經狀態、乳腺癌家族史、懷孕史、飲酒史、吸煙史，同時收集研究組患者淋巴結轉移情況、AJCC階段、ER和PgR狀態。抽取所有受試者約2ml肘靜脈血，抽提基因組DNA，通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）對PON1基因L55M和Q192R位點進行基因分型。用于擴增L55M位點目的片段的引物序列如下：正向，5′-GAAGAGTGATGTATAGCCCCAG-3′；反向，5′-TTTAATCCAGAGCTAATGAAAGCC-3′（170bp）。用于擴增Q192R位點目的片段的引物序列如下：正向，5′-TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3′；反向，5′-CACGCTAAACCCAAATACATCTC-3′（99bp）。PCR 擴增體系為 25μl，分別為 1.0μl的各引物，12.5μl的 Green PCR Master Mix（ThermoFisher，美國，貨號 K1081，規格200reactions），9.5μl的無菌去離子水和 2.0μl的模板DNA。PCR儀器為美國伯樂公司T100熱循環儀，PCR反應程序為：95℃熱變性 5min，95℃ 45s，60℃（L55M）或59℃（Q192R）45s，72℃ 45s，40 個循環，然后在 72℃孵育10min。PCR產物在2.5%瓊脂糖凝膠上分離，隨后用溴化乙錠（Sigma,批號E8751,規格1g）染色觀察。進行RFLP分析以檢測PCR擴增后的目的片段基因型。將消化的片段在3%瓊脂糖上分離，并使用Bio-Rad GelDoc 2000 XR+System（美國伯樂公司）顯色。每次運行中設置陰陽性對照，以確?；蛐驮u估的準確性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。使用Pearson雙側 χ2檢驗評估Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。比較兩組一般資料的差異時，計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；分類變量組間比較采用χ2檢驗。研究組和對照組的基因型和等位基因頻率的差異采用χ2檢驗。采用單因素logistic回歸分析計算乳腺癌的風險，并計算單純基因型或等位基因的粗略OR值和95%CI；采用Bonferroni校正年齡、BMI、絕經狀態、乳腺癌家族史、懷孕史、飲酒史、吸煙史等參數，采用多因素logistic回歸分析計算校正后的OR值和95%CI。采用多因素logistic回歸分析確定基因型頻率與臨床病理參數之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組L55M位點等位基因和基因型頻率分布兩組受試者的L55M位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。總體分析結果和基于絕經狀態的分組分析結果均顯示研究組和對照組L55M位點基因型和等位基因頻率之間的差異均有統計學意義（均P＜0.05）?？傮w分析結果顯示，LL基因型頻率與LM和MM基因型頻率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。在亞組分析中，LL基因型的頻率也與LM基因型的頻率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。此外，在整體和亞組分析中，LL基因型頻率與攜帶M基因的頻率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。以LL基因型和L等位基因作為參考，分析乳腺癌的發病風險，結果顯示LM基因型、MM基因型、LM+MM基因型或M等位基因與乳腺癌發病風險增加有關（均P＜0.05）。

在基于絕經狀態的亞組分析中，絕經前兩組受試者中觀察到的L55M位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。由于在對照組中未觀察到MM基因型，所以無法檢查MM基因型與乳腺癌發病風險之間的關聯。具有LM基因型和LM+MM基因型或M等位基因與乳腺癌發病風險增加有關（均P＜0.05）。絕經后兩組受試者中觀察到的L55M位點基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。LM 基因型、LM+MM基因型或M等位基因與乳腺癌發病風險增加有關（均P＜0.05），見表 2。

表2 兩組L55M位點等位基因和基因型頻率分布[例（%）]

2.2 兩組Q192R位點等位基因和基因型頻率分布兩組受試者的Q192R位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。總體分析結果顯示研究組和對照組Q192R位點基因型和等位基因頻率之間的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。以QQ基因型和Q等位基因作為參考，分析乳腺癌的發病風險，總體分析結果顯示，QR基因型、RR基因型、QR+RR基因型或R等位基因與乳腺癌發病風險無關（均P＞0.05）。基于絕經狀態的分組分析結果顯示研究組和對照組Q192R位點基因型和等位基因頻率之間的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。Q192R基因型或等位基因頻率與乳腺癌發病風險均無關（均P＞0.05），見表3。

表3 兩組Q192R等位基因和基因型頻率分布[例（%）]

2.3 L55M和Q192R位點基因多態性與乳腺癌患者臨床病理參數的關系 本研究檢測了L55M和Q192R位點基因多態性與乳腺癌患者臨床病理參數之間的關系，總體分析結果顯示M等位基因與絕經狀態和淋巴結轉移相關（均P＜0.05）?；诮^經狀態的分組分析結果顯示在絕經前和絕經后攜帶M等位基因的乳腺癌患者更容易發生淋巴結轉移（均P＜0.05），而Q192R等位基因的突變情況與臨床病理參數之間均無關聯（均P＞0.05），見表 4～5。

3 討論

本研究結果顯示，乳腺癌患者的LM基因型、MM基因型和M等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義，與相關研究結果一致[17]。此外，筆者采用Bonferroni校正多次測試，使統計學P值更加標準化，通過logistic回歸分析可能更適合于探索L55M位點基因多態性與乳腺癌風險之間的關聯。研究結果顯示，與LL基因型相比，具有LM基因型患者的乳腺癌風險增加了1.543倍，而具有MM基因型患者的乳腺癌風險增加了1.906倍。另外，LM＋MM基因型或M等位基因攜帶者患乳腺癌風險分別增加了1.579倍和1.545倍。此外，MM基因型患者的乳腺癌風險高于至少1個M等位基因攜帶者（LM基因型、LM＋MM基因型和M等位基因）的風險，與國外研究結果一致[18]，然而，國外研究結果顯示，乳腺癌患者和正常人中攜帶M基因的頻率明顯高于本研究中的統計結果，可能是由于人種的差異所致。據單倍型圖（HapMap）數據庫的數據顯示，我國西部地區的種族人群比東部人群更容易出現M等位基因突變。本研究中對照組只有8.5%為M等位基因突變攜帶者，與HapMap數據庫中北京漢族人群的數據一致。另外，針對美國和埃及患者的研究結果顯示，L55M位點M等位基因突變攜帶者患乳腺癌的風險明顯更高[19]。

在基于絕經期的亞組分析中，絕經前對照組中未觀察到MM基因型。因此，需要較大的對照組樣本量來檢查這種基因型患者絕經狀態和乳腺癌風險之間的關系。Lucio等[20]研究發現，與對照個體相比，具有MM基因型的絕經前婦女的乳腺癌風險增加了3.83倍；然而，他們的研究未發現LM基因型患者患乳腺癌的風險增加。本研究中MM基因型與乳腺癌發病風險之間的相關性相對較弱，需要進一步擴大樣本量進行研究。

在研究組或對照組中，筆者均未發現Q192R位點等位基因和基因型頻率與乳腺癌發病風險的相關性，與Hussein等[19]研究一致。然而，Gallicchio等[21]發現 Q192R位點基因多態性與侵入性乳腺癌的發病風險降低有關，Lucio等[20]報道Q192R位點R等位基因與乳腺癌的發病風險降低有關。亞組分析研究發現僅在絕經后組才觀察到Q192R位點R等位基因與乳腺癌降低風險之間的關系[20]，這說明R等位基因不會降低絕經前婦女的乳腺癌風險。本研究中筆者并未發現在絕經前或絕經后組中Q192R位點基因多態性與乳腺癌風險之間的關系。本研究結果與Gallicchio等[21]的差異說明Q192R位點基因多態性與乳腺癌風險之間關系可能與人種差異有關。近年來，Meta分析探討了PON1基因Q192R位點基因多態性與乳腺癌發病風險的相關性，研究結果均認為Q192R位點基因多態性與乳腺癌風險并無顯著相關性[22-23]，但Fang等[22]發現R等位基因一般在亞洲人群中與癌癥風險降低相關。結合前面的研究和本次研究結果可以看出，R等位基因與中國人群對乳腺癌的易感性增加并無相關性。不過關于其他地區和民族群體的流行病學研究需要進一步研究。

表4 L55M位點基因多態性與乳腺癌患者臨床病理參數的關系

本研究在檢測L55M和Q192R位點基因多態性與乳腺癌患者臨床病理參數之間的關系時，總體分析結果顯示M等位基因與絕經狀態和淋巴結轉移相關。基于絕經狀態的亞組分析結果顯示在絕經前和絕經后攜帶M等位基因的乳腺癌患者更容易發生淋巴結轉移。在以前的兩項研究中也觀察到M等位基因與淋巴結轉移之間的關聯[17,24]。此外，Ahmed等[17]指出M等位基因與缺乏ER有關。本研究結果中也觀察到類似的趨勢，但是這種差異無統計學意義。相比之下，M等位基因與此處觀察到的絕經后狀態之間相關性的報道較少。Xu等[25]表明絕經狀態是中國人群發生乳腺癌的危險因素，M等位基因突變可能在促進腫瘤發展中發揮重要作用。相比之下，本研究未發現Q192R位點等位基因的突變情況與臨床病理參數之間的相關性。

表5 Q192R位點基因多態性與乳腺癌患者臨床病理參數的關系

綜上所述，本研究探討了PON1基因L55M和Q192R位點基因多態性與患乳腺癌風險之間的相關性。研究發現L55M位點M突變與患者的乳腺癌風險增加有關，并且可能在腫瘤發展中發揮重要作用。相比之下，Q192R位點R等位基因可能不是該群體中乳腺癌敏感性和預后的合適標記。然而，由于本研究樣本相對較小，不能夠分析我國不同民族女性差異的情況，其臨床意義可能有所限制。需要未來具有較大樣本量和不同種族婦女的研究，以研究PON1基因多態性作為乳腺癌風險和腫瘤預后的遺傳標記的作用。

[1]FerlayJ,Soerjomataram I,DikshitR,etal.Cancerincidence and mortality worldwide:Sources,methods and major patterns in GLOBOCAN2012[J].InternationalJournalofCancer,2015,136(5):E359.doi:10.1002/ijc.29210.

[2]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115.doi:10.3322/caac.21338.

[3]Kamińska M,CiszewskiT,opacka-Szatan K,et al.Breast cancer risk factors[J].Menopause Review,2015,14(3):196-202.doi:10.5114/pm.2015.54346.

[4]IsikA,Okan I,FiratD,etal.Anewprognostic strategyforgastric carcinoma:albumin level and metastatic lymph node ratio[J].Minerva Chirurgica,2014,69(3):147-153.doi:10.1016/s0939-4753(04)80149-2.

[5]中華預防醫學會婦女保健分會乳腺學組.中國乳腺癌患者生活方式指南[J].中華外科雜志,2017,55(2):81-85.doi:10.3760/cma.j.issn.0529-5815.2017.02.001.

[6]Grundy A,Richardson H,Schuetz JM,et al.DNArepair variants and breastcancerrisk[J].Environmental&MolecularMutagenesis,2016,57(4):269.doi:10.1002/em.22013.

[7]Foratyazdi M,Neamatzadeh H,Sheikhha MH,et al.BRCA1 and BRCA2 common mutations in Iranian breast cancer patients:a Meta analysis[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp,2015,16(3):1219-1224.doi:10.7314/APJCP.2015.16.3.1219.

[8]Zhao Y,Wang H,Pan YY,et al.Association of lipid profile levels in premenopausal and postmenopausal women with breast cancer:A meta-analysis[J].International Journal of Clinical&Experimental Medicine,2016,9(2):552-563.doi:10.1007/978-3-319-26012-9_22.

[9]Wu J,Fang M,Zhou X,et al.Paraoxonase 1 gene polymorphisms are associated with an increased risk of breast cancer in a population of Chinese women[J].Oncotarget,2017,8(15):25362-25371.doi:10.18632/oncotarget.15911.

[10]Wei GZ,Zhu MY,Fang W,et al.Paraoxonase(PON1)polymorphisms Q192R and L55M are not associated with human longevity[J].Z GerontolGeriatri,2016,49(1):24-31.doi:10.1007/s00391-015-0892-1.

[11]Kota SK,Meher LK,Kota SK,et al.Implications of serum paraoxonase activity in obesity,diabetes mellitus,and dyslipidemia[J].Indian Journal of Endocrinology&Metabolism,2013,17(3):402-412.doi:10.4103/2230-8210.111618.

[12]AtayAE,Kaplan MA,Evliyaoglu O,et al.The predictive role of Paraoxonase 1(PON1)activity on survival in patients with metastatic and nonmetastatic gastric cancer[J].Clinica Terapeutica,2014,165(1):1-5.doi:10.7471/CT.2014.1663.

[13]Ibrahim AA,El-Lebedy D,Ashmawy I,et al.Association between paraoxonase-1 gene Q192R and L55M polymorphisms in systemic lupus erythematosus(SLE)and anti-phospholipid syndrome(APS)in a population from Cairo of Egypt[J].ClinicalRheumatology,2017,36(6):1-6.doi:10.1007/s10067-017-3567-z.

[14]Wu GC,Liu HR,Leng RX,et al.Subclinicalatherosclerosis in patients with systemic lupus erythematosus:a systemic review and meta-analysis[J].Autoimmunity Reviews,2016,15(1):22-37.doi:10.1016/j.autrev.2015.10.002.

[15]Lei C,Wei L,Lu F,et al.Association between L55M polymorphism in Paraoxonase 1 and cancer risk:a meta-analysis based on 21 studies[J].Oncotargets&Therapy,2016,9(Issue 1):1151.doi:10.2147/OTT.S96990.

[16]中國抗癌協會乳腺癌專業委員會.中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2013版)[J].中國癌癥雜志,2013,28(8):637-693.doi:10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.010.

[17]Ahmed NS,Shafik NM,Elraheem OA,et al.Association of paraoxonase-1(Q192Rand L55M)gene polymorphisms and activitywith colorectal cancer and effect of surgical intervention[J].Asian Pacific Journalof Cancer Prevention Apjcp,2015,16(2):803-809.doi:10.7314/apjcp.2015.16.2.803.

[18]Türe M,Yildiz M,KarkucakM,etal.Investigation ofTNF-alpha gene(G308A)and GSTP1 gene(Ilel05Val)polymorphisms in Turkish patients with retinopathyofprematurity[J].Turkish JournalofMedical Sciences,2015,45(1):164-168.doi:10.3906/sag-1307-94.

[19]Hussein YM,Gharib AF,Etewa RL,et al.Association of L55M and Q192R polymorphisms in paraoxonase 1(PON1)gene with breast cancer risk and their clinical significance[J].Molecular&Cellular Biochemistry,2011,351(1-2):117-123.doi:10.1007/s11010-011-0718-4.

[20]Lucio C,Talesa VN,Stefania G,et al.CYP17,GSTP1,PON1 and GLO1 gene polymorphisms as risk factors for breast cancer:an Italian case-control study[J].BMC Cancer,2009,9(1):115.doi:10.1186/1471-2407-9-115.

[21]Gallicchio L,Mcsorley MA,Newschaffer CJ,et al.Body mass,polymorphisms in obesity-related genes,and the risk of developing breast cancer among women with benign breast disease[J].Cancer Detection&Prevention,2007,31(2):95-101.doi:10.1016/j.cdp.2007.02.004.

[22]Fang DH,Fan CH,Ji Q,et al.Differential effects of paraoxonase 1(PON1)polymorphisms on cancer risk:evidence from 25 published studies[J].Molecular Biology Reports,2012,39(6):6801-6809.doi:10.1007/s11033-012-1505-3.

[23]Zhang M,Xiong H,Fang L,et al.Paraoxonase 1(PON1)Q192R gene polymorphism and cancer risk:A Meta-analysis based on 30 publications[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(10):4457-4463.doi:10.7314/APJCP.2015.16.10.4457.

[24]Hussein YM,Gharib AF,Etewa RL,et al.Association of L55M and Q192Rpolymorphisms in paraoxonase 1(PON1)gene with breast cancer risk and their clinical significance[J].Molecular&Cellular Biochemistry,2011,351(1-2):117-123.doi:10.1007/s11010-011-0718-4.

[25]Xu YL,Sun Q,Shan GL,et al.Risk factors ofbreast cancer in china:a case-control study[J].Med J Pumch,2011,2(5):7-14.doi:10.5114/aoms.2012.28558.