子宮平滑肌前列腺素E2受體分布與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究

李旭升 洪麗霞 金慶躍

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28周以內(nèi)2次以上連續(xù)發(fā)生的自然流產(chǎn)[1]，是妊娠期婦女的常見并發(fā)癥之一[2]，發(fā)病率約占育齡夫婦的5%[3]。引起RSA的因素復(fù)雜多樣，約50%的RSA的發(fā)病機(jī)制尚不明確[4]。有許多未知的體內(nèi)外刺激能夠引起子宮平滑肌細(xì)胞異常收縮，從而造成流產(chǎn)[5]。前列腺素（prostaglandin，PG）是一類普遍存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的具有多種生理作用的活性脂質(zhì)[6]，它通過(guò)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和不同的膜相關(guān)前列腺素E合成酶（membrane-associated prostaglandin E synthase，mPGES）催化產(chǎn)生[7]。子宮的PG主要來(lái)源于子宮內(nèi)膜，前列腺素E受體（EP）主要在肌細(xì)胞膜上表達(dá)[8]。PG能引起子宮強(qiáng)烈的收縮，非妊娠子宮的EP含量高于妊娠子宮[9]。筆者推測(cè)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其受體EP表達(dá)水平的異常可能與RSA有關(guān)。然而RSA患者的PGE2的合成水平和子宮平滑肌細(xì)胞EP受體的分布情況鮮有報(bào)道，其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。本研究測(cè)定了RSA患者子宮蛻膜組織中COX-2、mPGES和PGE2的表達(dá)和子宮平滑肌細(xì)胞中EP受體的分布及其下游的信號(hào)分子鈣離子和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，以探討 PGE2/EP系統(tǒng)在RSA中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2015年6月至2016年10月金華市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收治的37例RSA患者作為RSA組。RSA患者入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）B超提示胚胎已死亡，自然流產(chǎn)次數(shù)＞2 次；（2）孕 12周以內(nèi)；（3）染色體核型、婦科檢查、抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（Coombs試驗(yàn)）、優(yōu)生4項(xiàng)（TORCH檢測(cè)）、抗心磷脂抗體檢測(cè)等均無(wú)異常；（4）無(wú)其他急慢性疾病；（5）丈夫精液檢查正常。選擇同期正常早期妊娠的采用吸宮術(shù)人工流產(chǎn)的48例孕婦作為對(duì)照組。RSA 組年齡 22～30（26.8±3.1）歲，孕周 8～13（8.9±2.2）周，未接受任何藥物保胎治療；對(duì)照組年齡21～30（25.9±2.7）歲，孕周 8～11（9.2±1.9）周；兩組對(duì)象年齡和孕周比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 PGE2ELISA試劑盒、cAMP ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBY Green Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；鈣離子檢測(cè)染料Fluo-3 AM購(gòu)自日本東仁化學(xué)公司；PCR引物由上海博尚生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 子宮平滑肌細(xì)胞分離與鑒定 子宮肌膜組織通過(guò)宮腔鏡活檢獲得，并立即進(jìn)行后續(xù)子宮平滑肌細(xì)胞分離。取子宮肌膜組織約0.5g，置于冰冷的Hank′s平衡緩沖液（HBSS）中，洗凈組織表面血污。于10ml培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科剪將組織剪碎成漿樣，加入HBSS緩沖液5ml，吹打制成組織懸液，8 000r/min離心2min，棄上清液。留下的組織內(nèi)加入20%FBS 2ml，吹打，再次離心夾取組織塊，點(diǎn)種于6孔板或12孔板，向培養(yǎng)孔內(nèi)緩慢加入20%FBS約2ml，使液面剛好沒過(guò)組織塊。將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入孵箱。前4d可不必觀察。每4～6d換液1次，若有組織塊漂起，可吸除。觀察至組織塊之間的細(xì)胞互相融合，即可直接用于實(shí)驗(yàn)處理，或傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。利用α-actin熒光抗體進(jìn)行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下可看到細(xì)胞被染成綠色熒光。

1.3.2 蛻膜組織中COX-2、mPGES和子宮平滑肌細(xì)胞中EP受體表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR。蛻膜組織通過(guò)負(fù)壓吸引術(shù)獲得，于液氮中保存使用。將蛻膜組織從液氮中取出，置于1ml Trizol試劑中。對(duì)于分離的培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)板的子宮平滑肌細(xì)胞，每孔中加入Trizol試劑中，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中。振蕩混勻后冰上放置5min，12 000g離心15min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10min，12 000g離心15min，棄上清液，向離心管中加入1ml預(yù)冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩后7 500g離心5min，棄上清液，沉淀用無(wú)RNA酶的雙蒸水溶解。按說(shuō)明書所述方法提取mRNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RTPCR的模板。各目標(biāo)分子的引物序列見表1。引物合成后稀釋為2μM。反應(yīng)體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 5μl，上游引物和下游引物各 1μl，cDNA 模板 1∶10 稀釋后取1μl，剩余用不含RNA酶的水補(bǔ)足，總體積10μl。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃ 30s；變性95℃ 3s；退火延伸60℃30 s；構(gòu)建溶解曲線。表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt。

1.3.3 蛻膜組織中PGE2表達(dá)水平檢測(cè) 向解凍的蛻膜組織加入蛋白酶抑制劑后，超聲破碎，23 000g離心15min，取上清液。根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書按照不同的稀釋倍數(shù)制備標(biāo)準(zhǔn)品，并將樣本按1∶10稀釋到ED1樣品緩沖液內(nèi)。按照說(shuō)明書操作步驟在酶標(biāo)儀上測(cè)量450nm處的光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)際的PGE2的含量。

表1 PCR引物序列

1.3.4 子宮平滑肌細(xì)胞中cAMP表達(dá)水平檢測(cè) 子宮平滑肌細(xì)胞中cAMP表達(dá)水平按照ELISA試劑盒要求處理細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 胞內(nèi)鈣離子信號(hào)檢測(cè) 將1～5mM的鈣離子熒光探針Fluo-3 AM母液用HBSS緩沖液配制成1～5μM的工作液，取出分離的子宮平滑肌細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞3次；加入Fluo-3 AM工作液，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10～60min；去除殘留的Fluo-3 AM工作液，然后加入HBSS緩沖液覆蓋細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱孵育約20～30min，以確保鈣離子熒光探針Fluo-3 AM在細(xì)胞內(nèi)被酯酶剪切從而與鈣離子結(jié)合。采用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)480～500nm，發(fā)射波長(zhǎng)525～530nm。利用IPWIN32軟件分析兩組數(shù)據(jù)熒光強(qiáng)度差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組蛻膜組織中COX-2、mPGES和PGE2表達(dá)水平比較 RSA組蛻膜組織中COX-2和mPGES表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。RSA組蛻膜組織中PGE2表達(dá)水平為（72.26±27.42）pg/ml，顯著高于對(duì)照組的（61.61±18.2）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 兩組蛻膜組織中COX-2和mPGES表達(dá)水平比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 兩組子宮平滑肌細(xì)胞中EP受體表達(dá)水平比較RSA組子宮平滑肌細(xì)胞中EP1和EP3表達(dá)水平均高于對(duì)照組（均P＜0.01），而EP2表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而兩組子宮平滑肌細(xì)胞中EP4表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 兩組子宮平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度和cAMP表達(dá)水平比較 RSA組子宮平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3（插頁(yè)）。RSA組子宮平滑肌細(xì)胞中cAMP表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

圖2 兩組子宮平滑細(xì)胞中EP受體表達(dá)水平比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 兩組子宮平滑肌細(xì)胞中cAMP表達(dá)水平比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.01）

3 討論

RSA是困擾育齡婦女的頑疾之一，近年隨著環(huán)境變化等因素的影響RSA發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)，且RSA復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)隨著自然流產(chǎn)次數(shù)的增加而增加，有3次流產(chǎn)經(jīng)歷的RSA患者如果得不到及時(shí)有效的治療，多數(shù)將再次自然流產(chǎn)，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷[10]，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點(diǎn)。染色體異常是公認(rèn)的最常見因素[11]；其次還有解剖因素，包括子宮畸形、宮頸功能不全等；另外，內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素等也是RSA的常見因素之一；除此之外，子宮平滑肌的不正常收縮也可能與RSA的發(fā)生有關(guān)[12]。在妊娠的早期階段，適當(dāng)?shù)淖訉m平滑肌收縮有利于受精和著床。著床后至分娩前，子宮處于不規(guī)則、無(wú)痛性、稀發(fā)和不對(duì)稱收縮的相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。然而，如果受到體內(nèi)外不確定因素的影響，子宮收縮的穩(wěn)態(tài)被打破，就有可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

王育等[13]研究發(fā)現(xiàn)絨毛組織中COX-2及其催化的PG通過(guò)影響胚胎的著床，從而參與RSA的發(fā)病機(jī)制。Popovic等[14]報(bào)道PGE2在RSA患者的蛻膜組織中的含量高于手術(shù)流產(chǎn)組，而在硫前列酮誘導(dǎo)的藥物流產(chǎn)人群中，其蛻膜組織中PGE2水平和RSA患者相當(dāng)。這提示PGE2急劇上升造成子宮收縮，進(jìn)一步導(dǎo)致了流產(chǎn)的發(fā)生。本研究也得到了與類似結(jié)果，RSA組蛻膜組織中PGE2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，負(fù)責(zé)合成PGE2的mPGES表達(dá)水平也高于對(duì)照組。RSA患者蛻膜組織中mPGES水平上調(diào)，導(dǎo)致PGE2的合成水平增加，這揭示了PGE2的上調(diào)參與了RSA的疾病進(jìn)程。

PG主要通過(guò)和其位于細(xì)胞膜上的受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮其生理作用。PGE2至少能夠和4個(gè)亞型的EP受體結(jié)合，這些EP亞型受體均是G蛋白偶聯(lián)受體，每一種受體會(huì)介導(dǎo)不同的信號(hào)通路[15]。第二信使鈣離子、三磷酸肌醇（IP3）和cAMP在子宮收縮中起著關(guān)鍵性的作用。Slater等[16]報(bào)道維持妊娠期間蛻膜的正常功能，需要較低的PG水平和較高的cAMP水平，流產(chǎn)的發(fā)生往往是出現(xiàn)了是較高的PG水平和較低的cAMP水平。鈣離子能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的收縮，而cAMP則能夠促進(jìn)子宮的靜止。為了解在RSA中哪些EP受體及其偶聯(lián)的G蛋白以及第二信使在發(fā)病過(guò)程中起到了重要的作用，筆者利用RT-PCR分析了子宮平滑肌細(xì)胞中EP的分布情況，發(fā)現(xiàn)EP1和EP3表達(dá)上調(diào)，而EP2表達(dá)下調(diào)。EP2和EP4通過(guò)異三聚體的G蛋白Gαs刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性，促進(jìn)cAMP的合成；而EP3則通過(guò)Gαi抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，降低cAMP的合成；EP1通過(guò)Gq蛋白促進(jìn)磷脂酶C（PLC）的活性，使胞內(nèi)鈣離子水平升高。綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EP1的上調(diào)促進(jìn)了胞內(nèi)鈣離子的升高，而EP3上調(diào)和EP2下調(diào)則造成了cAMP水平的下降，其產(chǎn)生的共同結(jié)果就是子宮平滑肌細(xì)胞異常活躍的收縮。

綜上所述，RSA患者子宮蛻膜組織的COX-2和mPGES表達(dá)上升，增加了子宮蛻膜PGE2的合成。PGE2作用于子宮肌層的EP受體，激活了下游信號(hào)通路，而子宮平滑肌細(xì)胞的EP1和EP3上調(diào)進(jìn)一步促進(jìn)胞內(nèi)鈣離子濃度和cAMP水平的變化，從而造成了子宮異常的收縮，可見PGE2/EP系統(tǒng)異常可能參與了RSA的發(fā)病。本研究為抗RSA藥物的開發(fā)提供了新的思路。

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