HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸錐切術(shù)后ASC-US患者分流診斷的價值

張飛芳 葉麗燕

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第4位[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計，2008年中國約有75 000例新發(fā)病例，約33 000例死于宮頸癌[2]。宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的一組癌前病變。近年來隨著宮頸癌篩查方式的發(fā)展以及人們對宮頸癌預(yù)防意識的普遍增強，高級別CIN（Ⅱ、Ⅲ級）和早期宮頸癌檢出率不斷增加。目前，宮頸錐切術(shù)是高級別CIN的主要診療手段，但術(shù)后仍存在5%～25%[3]的復(fù)發(fā)率及病灶殘留率，發(fā)展為宮頸癌的概率約為正常人的4～5倍[4]。不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）是宮頸錐切術(shù)后宮頸殘端常見的細胞學(xué)異常結(jié)果，有進一步發(fā)展為高級別CIN甚至宮頸癌的可能。對宮頸殘端ASC-US患者的分流處理是宮頸錐切術(shù)后隨訪處理中的爭論點?，F(xiàn)對本院160例有完整隨訪臨床資料，并于宮頸錐切術(shù)后隨訪中宮頸殘端細胞學(xué)檢測結(jié)果為ASC-US的患者進行回顧性分析，探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA檢測在宮頸錐切術(shù)后宮頸殘端ASC-US患者分流中的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 從2013年4月至2016年10月在本院婦產(chǎn)科行宮頸錐切術(shù)并經(jīng)組織病理學(xué)確診為CINⅡ、Ⅲ級的4 832例患者中選取術(shù)后3、6、12、18和24個月隨訪門診復(fù)查液基細胞學(xué)技術(shù)（thinprep cytologic test，TCT）、高危型 HPV（HR-HPV）DNA、HPV mRNA E6/E7，且隨訪中細胞學(xué)檢查結(jié)果為ASC-US并行陰道鏡檢查及宮頸活檢的患者 160 例，年齡 23～64（41.3±7.5）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）已婚非妊娠婦女；（2）年齡 21～70 歲；（3）無內(nèi)科免疫系統(tǒng)疾病及使用相關(guān)藥物史；（4）無全子宮切除史，無化療及盆腔放療史；（5）初次錐切切緣陰性，術(shù)后病理結(jié)果無升級；（6）臨床隨訪資料完整。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢測 月經(jīng)干凈3d后采集標(biāo)本，使用TCT檢測專用刷插入患者宮頸管旋轉(zhuǎn)5周，停留10s，收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細胞，將刷頭置入裝有CytoRich細胞保存液的收集瓶中待檢。采用廣州安必平公司生產(chǎn)的TCT系統(tǒng)，全自動染色。按照2001年伯塞斯達系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）標(biāo)準(zhǔn)診斷為 ASC-US。

1.2.2 HR-HPV DNA檢測 月經(jīng)干凈后采樣，采集標(biāo)本前3d內(nèi)禁止性生活。專門的HPV DNA取樣刷采集宮頸分泌物，應(yīng)用PCR反向點雜交技術(shù)檢測HR-HPV DNA，包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、S1、52、56、58、59、66、68、73。嚴格按照HPV基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）說明書操作，1種HR-HPV陽性即為陽性。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)測定 使用專用刷在宮頸外口逆時針旋轉(zhuǎn)5周，停留10s，將得到的標(biāo)本置

于標(biāo)本保存管中。采用HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒和QuantiVirusTM冷光儀（均由鄭州科蒂亞生物技術(shù)公司生產(chǎn)），結(jié)果經(jīng)電腦軟件換算為拷貝數(shù)，以HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)＜1copy/ml為陰性，≥1copy/ml為陽性。嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 由本院專職陰道鏡醫(yī)師用電子陰道鏡觀察，并于醋酸白試驗和碘試驗異常區(qū)行選擇性多點組織活檢或取宮頸3、6、9、12點行常規(guī)活檢，必要時加行宮頸管搔刮。病理報告方式：宮頸正?；蜓装Y、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌。病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，以CINⅡ＋級（包括CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸癌）和CINⅢ＋級（包括CINⅢ級和宮頸癌）為研究終點，以CINⅡ-級（包括正常/炎癥和CINⅠ級）和CINⅢ-級（包括正常/炎癥、CINⅠ級和CINⅡ級）為對照組。

1.2.5 診斷標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后3～6個月內(nèi)復(fù)查仍有CIN病變者為病變殘留；術(shù)后6個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)CIN病變，但6個月后再次發(fā)現(xiàn)病變者，判定為CIN病變復(fù)發(fā)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。以組織病理診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，分別計算HR-HPV DNA檢測與HPV E6/E7 mRNA檢測兩種隨訪方法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及診斷正確率。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結(jié)果與病理診斷（金標(biāo)準(zhǔn)）比較 160例宮頸錐切術(shù)后殘端ASCUS患者中，HPV E6/E7 mRNA檢測陽性52例，陽性率為32.5%，其中有45例（86.5%）殘留/復(fù)發(fā)；HR-HPV DNA檢測陽性98例，陽性率為61.3%，其中67例（68.4%）殘留/復(fù)發(fā)；HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率低于HR-HPV DNA檢測陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CINⅡ-級HR-HPV DNA檢測陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；但 CINⅡ＋級 HR-HPV DNA 與 HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CINⅡ＋級與CINⅢ＋級的HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；CINⅡ＋級和CINⅢ＋級的HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率分別高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。病理檢查結(jié)果與HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結(jié)果見表1。

表1 HPV E6/E7 mRNA、HR-HPV DNA檢測結(jié)果與病理診斷（金標(biāo)準(zhǔn)）比較[例（%）]

2.2HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測對CINⅡ＋級病灶殘留/復(fù)發(fā)的診斷價值 HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度、陽性預(yù)測值和診斷正確率均高于HR-HPV DNA檢測，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)；而兩種方法靈敏度和陰性預(yù)測值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表 2。

表2 HPV E6/E7 mRNA和HR-HPV DNA檢測對CINⅡ＋級病灶殘留/復(fù)發(fā)的診斷價值

2.3 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)比較 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。另有宮頸癌1例，其HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)為38 935.28copies/ml。宮頸病變級別高的患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)明顯增加，兩者呈正相關(guān)（r＝0.658，P＜0.01），見表 3。

表3 不同級別宮頸病變HPVE6/E7mRNA拷貝數(shù)比較（copies/ml）

3 討論

高級別CIN病灶具有多發(fā)、不連續(xù)的特點，患者經(jīng)宮頸錐切術(shù)治療后進展為宮頸浸潤癌的概率較未經(jīng)治療者顯著降低，但仍高于普通人群。病變殘留/復(fù)發(fā)與HR-HPV 感染[5-6]、錐切術(shù)切緣陽性[7-8]、多項限受累[9]、年齡[6，10]等因素相關(guān)。其中，術(shù)后6個月內(nèi)HPV陽性是預(yù)測復(fù)發(fā)最重要的因素[5]。

ASC-US是宮頸錐切術(shù)后常見的細胞學(xué)異常結(jié)果，ASC-US可能是錐切術(shù)后細胞增生活躍的良性改變，也可能是進展為浸潤癌的惡性改變。因此，宮頸錐切術(shù)后ASC-US的分流管理一直是臨床工作中的難點與爭論點。2012年美國陰道鏡檢查與子宮頸病理學(xué)會（ASCCP）發(fā)布異常宮頸癌篩查和癌前病變的管理指南中指出[11]，CINⅡ/Ⅲ級患者宮頸錐切術(shù)后隨訪應(yīng)在術(shù)后12和24個月行細胞學(xué)檢測及HPV聯(lián)合檢測，若聯(lián)合檢測皆為陰性，則36個月再次行聯(lián)合檢測，若任意一次結(jié)果出現(xiàn)異常，則推薦行陰道鏡檢查及宮頸組織活檢。若所有結(jié)果未見異常，則按常規(guī)篩查20年，即使超過65歲。國內(nèi)宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南提出CIN患者應(yīng)每3～6個月行細胞學(xué)檢查隨，連續(xù)3次正常可改為一年一次[12]。2016年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（ACOG）宮頸癌篩查指南則指出既往CINⅡ/Ⅲ級治療后患者需比常規(guī)篩查更頻繁的篩查[13]，均未詳細提及術(shù)后殘端ASC-US患者的管理。宮頸錐切術(shù)后存在病灶復(fù)發(fā)/殘留的概率，可能與HR-HPV活化及持續(xù)感染、病灶不連續(xù)、宮頸管深處存在病灶有關(guān)。本研究納入患者均為切緣陰性患者，術(shù)后殘端ASC-US患者發(fā)生病灶殘留/復(fù)發(fā)的概率為31.9%（51/160），較以往報道高，這與研究對象選擇不同有關(guān)，也提示殘端ASC-US患者需要更為嚴密的監(jiān)測。

目前國內(nèi)聯(lián)合篩查方式主要為TCT聯(lián)合HR-HPV DNA檢測。HR-HPV DNA檢測能判斷HPV感染狀態(tài)，但無法檢測病毒的活躍程度，無法準(zhǔn)確評估病情進展。環(huán)形HPV基因線性隨機整合到宿主染色體后發(fā)生E6、E7基因非抑制性轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6/E7 mRNA翻譯產(chǎn)生E6、E7癌蛋白，干擾2個關(guān)鍵性腫瘤抑制蛋白p53、pRB的功能并加速其降解，使感染細胞易于出現(xiàn)細胞周期失控、細胞增生及DNA突變累積而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[14-15]。因此，目前認為HPV E6/E7 mRNA可反映與宿主細胞整合的HPV的活躍程度，可用于評估病情進展。一項納入8項研究的薈萃分析結(jié)果顯示[16]：在TCT結(jié)果為ASC-US及低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），并最終病理結(jié)果為CINⅡ＋級的患者中，HPV E6/E7 mRNA與HRHPV DNA相比較，兩者靈敏度相似，但HPV E6/E7 mRNA有更高的特異度。本研究對高級別CIN術(shù)后隨訪為 ASC-US的160例患者分析顯示：HPV E6/E7 mRNA檢測與HR-HPV DNA檢測CINⅡ＋級比較，HPV E6/E7 mRNA檢測特異度及陽性預(yù)測值分別為0.90、0.79，均明顯高于HR-HPV DNA檢測的0.49、0.43，但兩者靈敏度及陰性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與此項薈萃分析結(jié)果一致。在一項針對中國人群的研究中也得到了同樣的結(jié)論[17]。相對于HR-HPV DNA檢測，HPV E6/E7 mRNA檢測作為分流指標(biāo)，可降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，避免過多隨訪、過度檢查及治療，減少了醫(yī)療資源浪費和患者心理負擔(dān)。

本研究中宮頸錐切術(shù)后ASC-US患者CINⅡ+級和CINⅢ+級的HPV E6/E7 mRNA陽性率分別明顯高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，表明隨著宮頸病變進展，HPV E6/E7 mRNA檢出率增加。且宮頸病變級別高的患者HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)明顯增加，兩者呈正相關(guān)，提示HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)可在一定程度上提示患者的宮頸病變組織學(xué)改變，這與報道的HPV E6/E7 mRNA用于宮頸癌篩查的結(jié)果相一致[18-19]。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA檢測作為宮頸錐切術(shù)后ASC-US患者的分流指標(biāo)，相比HR-HPV DNA檢測具有高特異度，可以很好地預(yù)測術(shù)后病灶殘留/復(fù)發(fā)的風(fēng)險，能減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率的同時不降低高級別宮頸病變的檢出率，可以更精確地選擇高危人群，且可在一定程度上評估病變嚴重程度，具有較大的臨床應(yīng)用前景，但仍需更多多中心、大樣本的實驗數(shù)據(jù)的支持。

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