HPV E6/E7 mRNA檢測對絕經后婦女宮頸病變診斷的價值

王靜 徐小敏 蘭香 周燕

宮頸癌是除乳腺癌之外的最常見的女性惡性腫瘤。研究表明宮頸癌高發年齡為45～60歲，宮頸癌具有發現晚、預后差、病死率高等特點，已嚴重威脅絕經后婦女的身心健康[1-2]。目前液基細胞學技術（thinprep cytologic test，TCT）和高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）DNA檢測作為宮頸癌篩查的兩大手段已廣泛應用于臨床，且有效降低了宮頸癌的發病率。我國已步入老齡化社會，聯合篩查在這一群體中也廣泛應用。但由于絕經后婦女雌激素水平低，宮頸萎縮，宮頸細胞發生異型性改變，導致TCT存在一定的假陰性；而HPV DNA檢測只能反映病毒感染的類型，不能反映病毒致病的活性。HPV E6/E7 mRNA是HPV病毒持續感染并整合到人體基因組后，致癌活性激活產生的mRNA，代表著癌基因的活動，其檢測可以用于評估宮頸癌的發病風險和預后[3-4]。本研究通過對1 032例絕經后婦女的宮頸篩查結果進行分析，以病理診斷為金標準，將HPV E6/E7 mRNA與TCT及HR-HPV DNA進行比較，評價其診斷絕經后婦女宮頸病變的價值，為實現絕經后宮頸病變婦女早診早治提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年2月至2017年2月在本院行TCT和HR-HPV DNA聯合篩查的絕經后婦女1 032例，年齡 45～70（54.4±6.7）歲，絕經年限 1～25（8.5±6.3）年。排除標準：（1）既往有TCT異常史、HPV感染史及宮頸上皮內瘤變（CIN）史者；（2）有宮頸手術史者；（3）3d內有陰道沖洗及用藥者。

1.2 檢查方法

1.2.1 TCT、HR-HPV DNA檢測 去除宮頸表面黏液和分泌物，采用一次性宮頸刷深入宮頸管，同一方向旋轉5～10周，將已經刷取下脫落細胞的宮頸刷放入裝有細胞保存液的瓶中進行漂洗。TCT檢測結果按2001年伯塞斯達系統（the Bethesda system，TBS）分為正常范圍（NILM）、不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）、非典型鱗狀上皮細胞不除外高度病變（ASC-H）、鱗狀上皮內低度病變（LSIL）、鱗狀上皮內高度病變（HSIL）、鱗狀上皮細胞癌（SQCC）、不能明確意義的非典型腺細胞（AGUS）和腺癌（AC）。所有TCT涂片均由2位細胞學醫師獨立閱片和診斷。本研究以TCT結果≥ASC-US為細胞學陽性，＜ASC-US為細胞學陰性。HRHPV DNA檢測的耗材和試劑來自美國Hologic公司，用于檢測的細胞來自TCT檢測后剩余的細胞保存液。按基因親緣關系遠近將HR-HPV分為A5/A6組、A7組和A9組。A5/A6組檢測 HPV51、56和 66型，A7組檢測HPV18、39、45、59 和 68 型，A9 組檢測 HPV16、31、33、35、52和58型。TCT細胞學陽性者或（和）HR-HPV DNA陽性者均行HPV E6/E7 mRNA檢測、陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 檢測試劑盒及儀器均為河南新鄉科蒂亞生物技術有限公司產品。（1）取樣：樣本采集方法同TCT、HR-HPV DNA檢測。（2）檢測方法：經標本裂解、配置檢測緩沖液、布板、信號放大、讀板5個關鍵的步驟定量檢測HPV E6/E7 mRNA。（3）結果判讀：將所讀數據轉入數據處理軟件進行電腦計算，最后

檢測結果為拷貝數。本研究以HPV E6/E7 mRNA拷貝數≥1copy/ml為陽性。

1.2.3 陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷 拭去宮頸分泌物后分別行醋酸白及碘試驗，對醋酸白及碘試驗陰性者常規取3、6、9、12點組織活檢，而醋酸白異常及碘試驗陽性者在異常區域多點活檢。病理診斷標準參照2014年WHO修訂的婦女生殖器官腫瘤分類系統[5]。所有標本均由2位病理醫師獨立閱片和診斷。本研究以病理結果≥HSIL為病理陽性，＜HSIL為病理陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示；非正態分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用 Kruskal-Wallis H 檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；兩組變量的相關性分析采用Spearman秩相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理診斷與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果關系 1 032例絕經后婦女中，TCT細胞學陽性者154例，陽性率14.9%；HR-HPV陽性者210例，陽性率20.3%。其中TCT陽性或（和）HR-HPV DNA陽性者289例，均行HPV E6/E7 mRNA檢測、陰道鏡下宮頸活檢和病理診斷。HPV E6/E7 mRNA陽性者158例，陽性率54.7%。病理診斷陽性者51例，其中HSIL 44例，宮頸癌7例；病理陰性者238例，其中宮頸炎182例，LSIL 56例。病理診斷與 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果關系見表1。

表1 病理診斷與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測結果關系（例）

2.2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA 對病理分級HSIL以上（HSIL＋）診斷價值的比較 TCT診斷HSIL＋的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均低于 HPV E6/E7 mRNA，差異均有統計學意義（χ2＝31.335、4.862、15.736 和 20.357，均P＜0.05）。HR-HPV DNA診斷HSIL＋的靈敏度、陽性預測值、陰性預測值與HPV E6/E7 mRNA比較，差異均無統計學意義（χ2＝0.793、1.387和 0.004，均 P ＞0.05）；而特異度明顯低于HPV E6/E7 mRNA，差異有統計學意義（χ2＝20.794，P＜0.01）。3種檢測方法中HPV E6/E7 mRNA的特異度最高，見表2。

表2 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA對HSIL＋診斷價值的比較

2.3 不同病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達量的關聯性 以宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸癌作為4個不同的病理等級，比較不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA的表達量有無差異，結果發現不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA表達量差異有統計學意義（H＝15.644，P＜0.01）。Spearman秩相關分析顯示，病理分級與HPV E6/E7 mRNA 表達量呈正相關（r＝0.401，P＜0.01），見表 4。

表3 不同病理分級患者HPV E6/E7 mRNA表達量分布

3 討論

宮頸癌是女性發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。目前研究已經證實宮頸癌的明確病因是HR-HPV的持續感染。HR-HPV的復制與宮頸上皮細胞的分化直接相關，癌基因E6、E7在表面和中間層分化晚期的細胞中表達。HPV感染細胞的過程中，病毒基因組會整合到人基因組，其中癌基因E6、E7與細胞基因產物結合并對它們進行調控，改變細胞生長周期和DNA修復，造成基因組不穩定，從而導致細胞永生化。因此病毒癌基因E6、E7的連續表達是宮頸病變惡性轉化的必要條件。由此認為HPV E6/E7 mRNA檢測可以識別婦女HPV持續性感染及宮頸病變的風險[6-9]。HPV E6/E7 mRNA檢測作為重要的臨床輔助診斷技術，近年來已被歐洲生殖器感染和腫瘤研究機構作為重點研究對象[10]。

HPV E6/E7 mRNA檢測可檢測包括16、18等在內的14種HR-HPV的mRNA，不僅可以降低LSIL的陰道鏡活檢率，而且對HSIL的診斷及術后隨訪也有較高的價值[4]。Duvlis等[11]研究結果表明，在診斷HSIL時HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度及陽性預測值均高于HPV DNA檢測。而Ho等[12]也認為，在診斷HSIL時HPV E6/E7 mRNA檢測的特異度較好。Pierry等[13]研究發現，不管年齡＞30歲還是＜30歲，HPV E6/E7 mRNA檢測診斷HSIL的靈敏度均較高。Ho等[12]、Pierry等[13]及Benevolo等[14]均認為對細胞學為ASC-US及LSIL者，HPV E6/E7 mRNA比HPV DNA更適合作為分流的手段。Benevolo等[14]還指出，對于HPV陽性者，HPV E6/E7 mRNA作為分流的手段優于細胞學。以上研究表明，HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸疾病的診斷中應用廣泛，然而其在絕經后婦女這一特殊群體中宮頸疾病篩查的診斷價值目前少見報道。

國際婦產科聯盟（FIGO）統計顯示，70歲以上的宮頸癌患者占全部宮頸癌患者的12.0%[15]。中國醫學科學院腫瘤醫院一項研究也表明，≥65歲的宮頸癌患者占同期所有宮頸癌患者的10.8%，且中晚期患者比例高達89.3%[15]。深究原因可能為絕經后婦女由于健康意識差、思想保守等原因，較少參加婦科普查，不易發現早期宮頸病變；且絕經后婦女性生活減少，宮頸癌的早期癥狀如性生活出血不容易出現。TCT及HR-HPV DNA檢測技術作為目前先進的宮頸癌篩查技術，在宮頸癌的防治工作中發揮著非常重要的作用。但是絕經后婦女即使進行TCT及HR-HPV DNA檢測，假陽性率及假陰性率較非絕經期婦女明顯增高，且重復性差，從而導致部分婦女延誤或過度治療。主要有以下3方面原因：（1）絕經后婦女雌激素水平降低,下生殖道萎縮，宮頸鱗狀上皮層變薄，宮頸鱗-柱交界區常常上移，鱗-柱交界處細胞取樣困難，臨床往往難以取到滿意的細胞量，這直接影響了TCT制片質量及 HPV DNA提取；（2）絕經后婦女的TCT往往提示萎縮性細胞學改變，這與高度上皮內病變、不成熟化生等的鑒別有一定的困難；（3）在宮頸癌篩查工作中，篩查人員的專業水平、經驗、診斷水平及對診斷標準的把握等均影響篩查效果[16]。本研究中TCT的靈敏度（0.29）、特異度（0.42）均較低，而 HR-HPV 靈敏度（0.90）較高，但特異度（0.31）較低，這與上述結論一致。

絕經后婦女的 HPV病毒負荷量較高。研究發現HPV感染在人群中呈U型或S型分布，第1個高峰在25～35歲，第2個高峰在＞55歲年齡段[17]，且感染HRHPV婦女的年齡越大，越容易發生嚴重的宮頸病變[18]。本研究中7例宮頸癌患者中有6例年齡在55歲以上，全部感染HR-HPV，與以上研究結果一致。

本研究發現3種檢測方法中TCT的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值均較低，故筆者不推薦在絕經后婦女中單獨使用TCT作為宮頸癌的篩查手段。HPV E6/E7 mRNA在3種檢測方法中特異度最高，與TCT及HR-HPV DNA比較差異均有統計學意義，可見在絕經后婦女中HPV E6/E7 mRNA檢測較TCT及HR-HPV DNA更精準，能更為準確地篩選出高危人群。但HPV E6/E7 mRNA靈敏度為0.84，漏診率為15.7%，因此，筆者也不建議其單獨應用于絕經后婦女宮頸癌的篩查。近年來，多項研究表明在普通人群中HPV E6/E7 mRNA聯合細胞學檢測可提高宮頸癌早期篩查的準確性[19-21]；而作為細胞學異常的分流手段，HPV E6/E7 mRNA特異度明顯高于HR-HPV DNA[21]。結合本研究，筆者認為在絕經后婦女中也可將HPV E6/E7 mRNA與細胞學聯合檢測或將其作為細胞學或HR-HPV DNA檢測異常患者的分流手段。

本研究還發現，絕經后婦女HPV E6/E7 mRNA表達量越高，嚴重病變可能性越大，這與Ratnam等[22]及王璐等[23]的研究一致。這說明對于高表達量的患者要引起警惕。然而具體表達量的高低是否有明確的數據截點，有待于以后大樣本的研究明確。

綜上所述，絕經后婦女宮頸病變有其特殊性，應尋找適合其特點的篩查方案。HPV E6/E7 mRNA檢測對絕經后婦女HSIL+病變的篩查具有較高特異度，可與TCT聯合可用于宮頸癌初篩，也對宮頸癌常規篩查細胞學異常或HR-HPV陽性具有分流意義，有助于減輕絕經后婦女的心理負擔，避免臨床上的過度治療。且HPV E6/E7 mRNA表達量隨著宮頸病變嚴重級別的升高而增加，對預測絕經后婦女高級別CIN及宮頸癌的風險有重要的臨床價值。

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