牛膝多糖對硝普鈉誘導的兔關節軟骨細胞凋亡的影響及機制研究

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

骨關節炎是年齡相關性疾病，目前認為該病的病理核心是關節軟骨退變。筆者前一階段的臨床實驗已經證實，取自《千金方》中的獨活寄生湯和《醫林改錯》中的身痛逐瘀湯中的諸藥加以化裁而成的“骨痹活血湯”能明顯改善膝骨關節炎患者的臨床癥狀，并且對其體內炎癥因子NF-κB、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）等均具有明顯下調作用[1]。川牛膝是該方劑中的主要藥材，牛膝多糖（ABPS）則是中藥牛膝的有效成分，它是一種免疫調節劑。現代藥理學研究證實ABPS具有抗腫瘤、抗衰老、細胞毒和多種免疫調節作用。但在之前的臨床實驗中ABPS的治療作用是否是通過調控軟骨細胞凋亡信號傳導通路，從而延緩關節軟骨的退變，維持關節軟骨正常的生物力學功能，尚未進一步研究。本實驗通過建立體外培養的兔軟骨細胞體系，利用ABPS對軟骨細胞的凋亡以及凋亡信號傳導途徑進行研究，以期為其臨床應用提供更多的理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 6周齡新西蘭大白兔1只，體重0.6kg，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。DMEM完全培養基、FBS（美國GibcoBRL公司），甲苯胺藍、ABPS、白蘆藜醇、尼克酰胺、硝普鈉、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），實時熒光定量PCR試劑、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TAKARA公司），細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2X）（立陶宛 MBI Fermentas公司），Trizol抽提試劑盒（美國Invitrogen公司）。RT-PCR引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代軟骨細胞提取及培養 將新西蘭白兔于耳緣靜脈注射空氣處死。無菌操作下沿膝關節內側切開關節囊，暴露關節面，用手術刀片取關節表面軟骨，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS緩沖液沖洗數次后，移入超凈臺，將軟骨組織剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒搖蕩消化30min，輕輕吹打棄去上清液，用PBS緩沖液清洗3次；再加入2g/L的Ⅱ型膠原酶5ml并移入消化瓶中，將消化瓶放置恒溫搖箱中，消化3～4h。待大部分細胞游離時，經200目不銹鋼篩網過濾，用15ml離心管收集細胞，低溫離心1 000r/min，10min，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM培養基，用吸管輕輕吹打，使細胞懸液均勻分布。

1.2.2 軟骨細胞的觀察與鑒定 取軟骨細胞于倒置顯微鏡下觀察生長情況及形態變化特點，并進行攝片記錄。取對數生長期細胞進行爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺藍染色30min，顯微鏡下觀察軟骨細胞。

1.2.3 軟骨細胞培養 軟骨細胞置于5%CO2混和氣體環境中，37℃恒溫箱內單層培養，隔3d首次換液，傳代培養期間，每隔2～3d根據細胞生長情況更換1次完全培養基。待鏡下觀察細胞增殖匯集成片，并鋪滿培養瓶底。占底面積70%～80%可進行傳代培養，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞后，按1∶3比例接種至75cm2培養瓶中，并標記為P1代細胞。按上述方法，培養至P3代軟骨細胞。

1.2.4 分組 選取對數生長期的P3代軟骨細胞，以3×105個/孔接種于6孔板中，培養24h細胞貼壁后加入不同濃度藥物，分為：（1）無凋亡誘導組（10%FBS DMEM培養基培養）；（2）硝普鈉組（1.0mmol/L硝普鈉＋10%FBS DMEM 培養基培養）；（3）白蘆藜醇組（1.0mmol/L硝普鈉＋100μmol/L白蘆藜醇＋10%FBS DMEM培養基培養）；（4）尼克酰胺組（1.0mmol/L硝普鈉＋20mmol/L尼克酰胺＋10%FBS DMEM 培養基培養）；（5）ABPS 200μg/ml組（1.0mmol/L 硝普鈉＋200μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培養基培養）；（6）ABPS 300μg/ml組（1.0mmol/L硝普鈉＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM 培養基培養）；（7）ABPS 400μg/ml組（1.0mmol/L 硝普鈉＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培養基培養）。

1.2.5 軟骨細胞凋亡率檢測 根據1.2.4處理與分組細胞后，繼續培養48h后用不含EDTA的胰酶消化、收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，收集（1～5）×105細胞。加入100μl 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。避光、室溫反應 10min。加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 NAMPT、Sirt1、p53和 Bax mRNA 表達水平測定用Trizol法提取P3代軟骨細胞RNA，行RT-PCR法獲得cDNA，冰上混合脫氧核糖核酸嵌合熒光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl，上下游引物各 0.4μl、雙蒸水5.2μl及cDNA 4μl，輕輕混勻，離心5s后進行RTPCR檢測。反應條件為50°C預變性 2min，95°C變性10min，95°C 退火 30s，60°C 延伸 30s，40 個循環。反應完畢后分析產物溶解曲線判斷反應的特異性并通過2-ΔΔCt得到目的基因的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞鏡下觀察 制備的兔原代軟骨細胞體外培養狀態下大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形，72h基本全部貼壁生長，見圖1。

2.2 ABPS對硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡的影響 與無凋亡誘導組比較，硝普鈉組軟骨細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與硝普鈉組比較，白蘆藜醇組、ABPS各組軟骨細胞凋亡率均明顯下降（均P＜0.05），而尼克酰胺組軟骨細胞凋亡率明顯上升（P＞0.05）。與ABPS 200μg/ml組比較，ABPS 300μg/ml組及 ABPS 400μg/ml組軟骨細胞凋亡率明顯下降（均P＜0.05），見圖2-3。

圖1 兔膝關節軟骨細胞鏡下觀察（×200）

圖2 細胞凋亡流式分析圖

2.3 各組軟骨細胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表達水平比較 與無凋亡誘導組比較，硝普鈉組凋亡相關基因p53和Bax mRNA的表達明顯上調，抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表達明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與硝普鈉組比較，白蘆藜醇組NAMPT和Sirt1 mRNA的表達上調，p53和Bax mRNA的表達明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；尼克酰胺組NAMPT和Sirt1 mRNA的表達下調，BAX mRNA的表達上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。不同濃度ABPS組中，ABPS 300μg/ml組效果最明顯，NAMPT和Sirt1 mRNA的表達明顯上調，p53和Bax mRNA的表達明顯下調，與硝普鈉組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表 2。

3 討論

骨關節炎是一種常見的慢性關節疾病,其主要病變是骨關節軟骨的退行性病變和繼發骨質增生，是多種生物因素與機械損傷因素相互作用而引起的生物力學紊亂所致的病理改變[2-3]。最容易累及負重和關節活動度大的膝關節，其次為髖關節、脊柱、手指關節等部位。它所帶來的疼痛、關節功能障礙等癥狀嚴重影響了人們的生活質量。因此，如何有效地調控軟骨細胞的功能，維持關節軟骨正常生物學功能日益成為科研的重點。根據文獻，P1代至P3代兔關節軟骨細胞為研究退行性骨關節病最適宜的靶細胞[4]，因此，本實驗采用P3代兔關節軟骨細胞作為實驗對象，建立凋亡模型。

在細胞的生命活動過程中，細胞凋亡與細胞增殖一樣，都離不開信號的傳導，即細胞增殖或死亡的刺激信號通過細胞外、細胞膜、細胞漿、細胞核，最后產生應答的途徑傳導。近年來的研究一致認為p38信號通路是關節軟骨細胞凋亡的一條重要上游信號通路之一[5]。p38通過兩條途徑使p53蛋白表達增加而引起軟骨細胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一個上游激酶），從而使NF-κB活化，進而增加p53的轉錄表達；二是直接磷酸化p53的絲氨酸15殘基，穩定p53蛋白，使其含量增加。p53則通過誘導促凋亡因子Bax的表達而引起細胞凋亡[6]。與促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳動物的同源基因，是一種依賴NAD+的組蛋白去乙酰化，能與多種轉錄因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，調節其轉錄活性，與細胞衰老、凋亡、代謝和增殖分化密切相關。Takayama等[7]研究證實Sirt1與人體軟骨細胞凋亡相關。Liu等[8]發現SRT1720能夠激活Sirt1，抑制軟骨細胞凋亡。NAMPT廣泛表達于人體內臟脂肪組織、肌肉、骨骼、肝臟等器官和組織，并表達于神經細胞、成纖維細胞、心肌細胞、免疫細胞等多種細胞，可見該蛋白在生理及病理狀態下均有重要作用[9]。研究發現，NAMPT通過調節Sirt1活性控制相應基因轉錄和眾多代謝過程，具有抗凋亡作用[10]。硝普鈉可以誘導軟骨細胞凋亡[11]，本實驗中硝普鈉凋亡誘導組的p53、Bax基因的表達明顯高于其他組，說明在凋亡過程中存在p53-Bax信號傳導通路的異常激活。

圖3 ABPS對硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡的影響（與無凋亡誘導組比較，*P＜0.05；與硝普鈉組比較，△P＜0.05；與 ABPS 200μg/ml組比較，▲P＜0.05）

表2 各組軟骨細胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表達水平比較（n＝6）

本實驗利用了白蘆藜醇和尼克酰胺2種試劑，白蘆藜醇是Sirt1的激動劑[12]，尼克酰胺是Sirt1的抑制劑[13]。RT-PCR檢測發現白蘆藜醇能使NAMPT和Sirt1 mRNA表達上調，經p53-Bax途徑抑制硝普鈉誘導的關節軟骨細胞凋亡；尼克酰胺則下調NAMPT和Sirt1 mRNA的表達，并經p53-Bax途徑加強硝普鈉誘導的關節軟骨細胞凋亡。流式細胞儀對細胞凋亡率的檢測亦發現，白蘆藜醇組細胞凋亡率遠遠低于硝普鈉組，尼克酰胺組則高于硝普鈉凋亡誘導組，證明白蘆藜醇通過對Sirt1的調控抑制軟骨細胞的凋亡，而尼克酰胺能促使軟骨細胞凋亡，這與文獻報道也是一致的[14]。

本實驗在體外用ABPS干預硝普鈉誘導的軟骨細胞凋亡，發現ABPS有類似于白蘆藜醇的作用，能夠上調抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表達及下調凋亡基因p53和Bax mRNA的表達。流式細胞儀檢測同樣證實ABPS處理后，兔關節軟骨細胞凋亡率均有所降低，且凋亡率隨其濃度的增加而減小，表明ABPS對凋亡誘導條件下軟骨細胞具有保護作用，且在濃度為300μg/ml時即可以出現明顯效果。由此筆者得出初步結論，ABPS通過上調抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mR－NA的表達及下調凋亡基因p53和Bax mRNA的表達，經p53-Bax途徑來抑制硝普鈉誘導的關節軟骨細胞凋亡。這是ABPS保護軟骨細胞、預防骨關炎的機制之一，也為ABPS的臨床應用提供實驗依據。但是本研究也存在不足之處，例如ABPS具體通過影響哪種凋亡機制來保護軟骨細胞，還通過哪些信號傳導通路影響了凋亡機制等。鐘甫華等[15]利用實驗證實經前交叉韌帶離斷術4周制動飼養后，大白兔關節軟骨出現了降解破壞的形態特征，利用這種方法亦可以驗證ABPS是否在動物體內實驗中具有意義。以上幾個方面都將是后續研究重點關注的方向。

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