蒼南地區(qū)前列腺癌與HPV16/18感染的相關(guān)性研究

黃兆浪 莊小藝 周炳同 溫莉虹

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌產(chǎn)生的必要條件[1]，在高危型HPV中以HPV16/18感染最為常見，研究表明其至少占70%以上[2]。目前，文獻(xiàn)中關(guān)于HPV16/18感染與男性生殖系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系，特別是與前列腺癌（prostate cancer，PCa）的關(guān)系研究較少。本研究采用原位雜交方法檢測PCa石蠟標(biāo)本中HPV16/18感染情況，并與同期良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）作對照研究，同時(shí)采用免疫組化En Vision法檢測上述患者p16的表達(dá)情況，留取患者的尿液和部分活檢新鮮組織標(biāo)本分別做尿液和電鏡HPV檢查，探討HPV16/18感染與本地區(qū)PCa發(fā)生的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院2012至2016年P(guān)Ca患者存檔石蠟標(biāo)本 64例（PCa組），年齡 57～95（77.1±7.9）歲。抽取同期BPH患者72例作對照研究（BPH組），年齡59～88（72.7±7.2）歲。其中2016年臨床診斷為PCa的19例患者及BPH的27例患者同時(shí)留取尿液檢測高危型HPV，10例PCa和7例BPH患者的活檢新鮮組織標(biāo)本電鏡觀測病毒樣顆粒。上述檢查結(jié)果均經(jīng)2位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱確診后選取。

1.2 方法

1.2.1 原位雜交方法檢測HPV16/18感染情況 所有石蠟組織按如下程序進(jìn)行：10%中性甲醛固定、石蠟包埋切片、脫蠟、酶處理、變性雜交、顯色、復(fù)染等。所有標(biāo)本均設(shè)陰性對照與陽性對照，最后以細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性，無著色為陰性。

1.2.2 免疫組化En Vision法檢測p16表達(dá)情況 10%中性甲醛固定的組織經(jīng)脫水、包埋、切片后按免疫組化說明書的步驟進(jìn)行操作，設(shè)置陽性對照與陰性對照，再進(jìn)行復(fù)染、中性樹膠封固，最后光鏡下觀察。光鏡下陽性為胞核呈棕黃色或胞核與胞質(zhì)同時(shí)呈棕黃色，陰性為胞質(zhì)單獨(dú)著色或無著色。

1.2.3 尿液中高危型HPV的檢測 采用第二代雜交捕獲（HC2）法。留取患者清晨第一次前段尿液約10ml，置于15ml消毒帶蓋的離心試管中，經(jīng)離心、DNA裂解、雜交捕獲反應(yīng)、沖洗、信號收集后在DML2000系統(tǒng)上進(jìn)行結(jié)果判讀，與標(biāo)準(zhǔn)陽性進(jìn)行對照。檢測樣本的相對光單位（relative light unit，RLU），并且與標(biāo)準(zhǔn)陽性的 RLU 對比，如兩者比值≥1.0，提示高危型HPV感染，如＜1.0為陰性。

1.2.4 電鏡觀測組織中的HPV 活檢新鮮組織標(biāo)本立刻投入2.5%戊二醛緩沖液中作前固定（溫度4℃），然后改切為1mm 3小塊、經(jīng)緩沖液充分浸洗后、以1%四氧化餓溶液作后固定，采用超薄切片機(jī)切片、厚度50nm左右、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，最后用國立H500透射電鏡觀察攝像。在細(xì)胞核內(nèi)見到病毒樣顆粒（在異染色質(zhì)之間呈彌漫散布無明顯結(jié)構(gòu)或聚集成團(tuán)呈假結(jié)晶狀）為陽性，未見到者為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者HPV或p16陽性率比較 PCa組石蠟標(biāo)本中HPV16/18和p16陽性率均明顯高于BPH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；兩組尿液中高危型HPV陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。HPV16/18和p16陽性表達(dá)情況見圖1-2（插頁）。

2.2 電鏡觀測所見 納入電鏡檢查的10例PCa新鮮組織標(biāo)本表現(xiàn)為細(xì)胞核大小不一，畸形或異形，核仁粗大，伴有雙核仁或多核仁。胞質(zhì)內(nèi)形成大小不一、內(nèi)含微絨毛的微囊，其中4例在細(xì)胞核內(nèi)見到病毒樣顆粒，表現(xiàn)為在異染色質(zhì)之間呈彌漫散布無明顯結(jié)構(gòu)或聚集成團(tuán)呈假結(jié)晶狀，見圖3。7例BPH新鮮組織標(biāo)本電鏡下胞質(zhì)內(nèi)富含致密體和溶酶體，核仁不明顯，核大而不規(guī)則，未見病毒樣顆粒。

表1 兩組患者HPV或p16陽性率比較（%）

圖3 電鏡表現(xiàn)（a、b：白色箭頭示HPV樣顆粒在異染色質(zhì)之間呈彌漫散布無明顯結(jié)構(gòu)或聚集成團(tuán)呈假結(jié)晶狀，透射電子顯微鏡，×30 000；M：核膜；N：核仁）

3 討論

PCa是常見的男性惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球男性惡性腫瘤的第2位[3]。近年來我國發(fā)病率呈明顯上升趨勢，由2003年的6.53/10萬上升至2009年的9.92/10萬[4]。

PCa發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。盡管雄激素及雄激素受體（AR）信號在前列腺腺體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和發(fā)育中是必要的，并且AR信號幾乎驅(qū)動(dòng)著所有PCa細(xì)胞的生長，但是雄激素和AR信號是否參與了PCa的發(fā)生和增殖的早期階段，并沒有定論[5]。有研究表明前列腺組織較易被潛在致瘤性的病毒感染，包括HPV、多瘤病毒和皰疹病毒等[6]。其中，HPV作為最重要的腫瘤相關(guān)性病毒之一，已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)HPV感染特別是高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌產(chǎn)生的必要條件[1]，這其中又以HPV16/18感染最為常見，其至少占70%以上[2]。近年來分子生物學(xué)研究表明HPV16/18的E6/E7蛋白可使前列腺上皮細(xì)胞永生化[7]。

E6蛋白含151個(gè)氨基酸，包括2個(gè)鋅指狀結(jié)構(gòu)Cys-x-x-Cys，E7 蛋白含 CR1、CR2、CR3 等 3 個(gè)功能區(qū)的磷酸化核蛋白，共有98個(gè)氨基酸[8]。E6/E7蛋白可分別結(jié)合、降解抑癌基因p53及Rb，致使細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞周期調(diào)控失常，最終促使PCa的發(fā)生、發(fā)展[7]。

p16是一種多腫瘤抑癌基因，于1992年由Travis[9]在研究黑素瘤基因時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，該基因位于染色體9p21，其中包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子。研究表明HPV一過性感染可能不會(huì)出現(xiàn)p16過表達(dá)，而持續(xù)感染可能使Rb基因與其致癌蛋白E7結(jié)合后失活，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，破壞p16的負(fù)向調(diào)節(jié)通路，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。

國外對PCa與HPV16/18感染的相關(guān)性研究報(bào)道的較多，如Carozzi等[11]運(yùn)用PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)PCa患者中HPV16/18陽性表達(dá)明顯高于BPH患者。國內(nèi)這方面的研究少見報(bào)道。近年來，韋正樹等[12]采用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合反向點(diǎn)雜交（PCR-RDB）技術(shù)檢測了60例PCa患者和55例BPH患者前列腺組織中HPV16/18 DNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)前者陽性率為36.7%（22/60），后者為9.1%（5/55），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究采用原位雜交的方法，結(jié)果表明PCa組HPV16/18陽性表達(dá)率為23.4%，BPH組為4.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)p16的免疫組化結(jié)果顯示前者陽性率為25.0%，后者為8.3%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示HPV16/18感染可能與本地區(qū)PCa發(fā)病相關(guān)。本組送檢的10例PCa新鮮組織電鏡檢測發(fā)現(xiàn)4例胞核內(nèi)見病毒樣顆粒，而7例BPH組織均未見病毒樣顆粒，進(jìn)一步提示PCa與HPV感染有關(guān)。

Zambrano等[13]研究發(fā)現(xiàn)PCa患者尿液中HPV DNA陽性率高，在其選取的12例PCa患者尿液組織中檢測到6例HPV DNA陽性。本研究顯示PCa組尿液中高危型HPV陽性率為47.4%，BPH組為18.5%，PCa組陽性率明顯高于BPH組，可能與本地區(qū)自然環(huán)境、生活習(xí)慣等不同有關(guān)。

綜上所述，本地區(qū)PCa與HPV16/18的感染存在相關(guān)性，HPV16/18的感染可能是本地區(qū)PCa的發(fā)病因素之一。本研究受條件所限，只針對高危型HPV16/18進(jìn)行了檢測，對其他類型HPV未進(jìn)行相關(guān)檢測，結(jié)果可能存在一定的誤差，有待于今后進(jìn)一步研究。

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