FQ-PCR法與細菌培養法檢測妊娠晚期B族鏈球菌感染的效能比較及細菌耐藥性分析

楊潔 陳海迎 鄭建瓊 陳晶晶 黃志瓊 朱雪瓊

B 族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）又稱無乳鏈球菌，是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，常定植于女性下生殖道和腸道[1]。妊娠晚期GBS感染可引起胎膜早破、早產、羊膜腔感染等不良妊娠結局，另外，GBS還可以通過羊水或在分娩過程中經產道垂直傳播[2]，引起新生兒GBS感染，主要表現為肺炎、敗血癥和化膿性腦膜炎[3-4]。圍生期GBS感染對母嬰健康危害極大。據統計，歐美國家孕婦GBS感染率約10%～30%，而其中40%～70%通過生殖道垂直傳播給新生兒[5]。細菌培養法是GBS檢測的金標準，但耗時較長，且靈敏度較低，2010年最新的美國疾病控制與預防中心（CDC）GBS防治指南推薦對孕35～37周的孕婦進行陰道聯合直腸GBS的篩查，并指出可以使用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）法對GBS進行篩查[6]。本研究旨在探討FQ-PCR法和細菌培養法在妊娠晚期GBS感染檢測中的應用價值，并分析其耐藥性，為GBS的產前篩查和防治工作提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年2月1日至2017年1月31日于溫州市人民醫院產前檢查并住院分娩的961例孕婦作為研究對象。納入標準：（1）單胎妊娠；（2）孕 35～37 周時進行GBS帶菌狀況檢查；（3）取樣前1周內無性生活、陰道用藥及抗生素使用史。（4）經醫院倫理委員會批準和患者知情同意。排除標準：（1）合并嚴重心血管、肝、腎及免疫系統疾??；（2）合并其他生殖道感染者(細菌性陰道病、外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎、支原體、衣原體感染)；（3）產前明確胎兒畸形或死胎需引產者。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 首先將孕婦外陰分泌物擦拭干凈，2根無菌尼龍拭子小心插入陰道內，在陰道下段1/3處旋轉一周采集陰道分泌物，之后將拭子插入肛門，于肛門括約肌上緣2～3cm處輕輕旋轉一周采集直腸分泌物。標本采集完成后1h內送實驗室，24h內檢測，1個拭子用于PCR檢測，另1個用于細菌培養。

1.2.2 FQ-PCR法 PCR試劑盒購自博爾誠(北京)科技有限公司，實時熒光定量核酸擴增儀（C1000型）購自美國Bio-Rad公司。所有檢測過程及結果判讀嚴格按照操作說明進行。該方法是通過臨床收集到產婦分泌物，進行細菌DNA提取，在PCR技術平臺上，針對GBS基因組特異且無高頻單核苷酸多態性位點的序列區域環磷酸腺苷（CAMP）因子，設計出特異引物和探針，配以全封閉PCR體系，檢測標本中的GBS DNA。體系中通過加入內參照系統排除PCR過程中可能的假陰性結果，并通過加入UNG避免可能的擴增污染物造成的假陽性結果。

1.2.3 細菌培養法 將陰道直腸分泌物標本放入5%羊血培養基里，置于CO2培養箱內恒溫（35℃）培養18～24h。再把可疑的灰白色、圓形細菌挑選出來，做涂片進行革蘭染色鏡檢，鏡下革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，觸酶試驗陰性，CAMP試驗陽性，初篩為GBS，再上機（VITEK2）檢測確認。

1.2.4 分析內容 妊娠晚期孕婦GBS帶菌狀況、FQPCR法與細菌培養法檢出率。以FQ-PCR法聯合細菌培養法為金標準，分別計算2種方法的靈敏度、特異度、約登指數、陰性似然比，比較2種檢測方法的檢驗效能。根據細菌培養的藥敏試驗結果，分析GBS對13種抗菌藥物（青霉素G、替加環素、利奈唑胺、氨芐西林、萬古霉素、喹奴普汀-達福普汀、克林霉素、呋喃妥因、環丙沙星、莫西沙星、左旋氧氟沙星、氯潔霉素及四環素）的耐藥情況。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FQ-PCR法與細菌培養法檢出率比較 961例孕婦中2種檢測方法共檢出GBS感染者103例，妊娠晚期孕婦GBS檢出率為10.7%（103/961）。其中FQ-PCR法檢出GBS陽性100例，檢出率為10.4%（100/961）；細菌培養法檢出GBS陽性33例，檢出率為3.4%（33/961）；2 種方法檢出率比較差異有統計學意義（χ2＝63.23，P＜0.01）。

2.2 FQ-PCR法與細菌培養法檢驗效能比較 以FQPCR法聯合細菌培養法為金標準，FQ-PCR法檢測的靈敏度、特異度、約登指數、陰性似然比分別為0.98、1.00、0.98、0.02，細菌培養法檢測的靈敏度、特異度、約登指數、陰性似然比分別為 0.32、1.00、0.32、0.68，FQ-PCR 法檢測的靈敏度優于細菌培養法，差異有統計學意義（χ2＝61.35，P＜0.05），

2.3 GBS對抗菌藥物的耐藥分析 33例GBS菌株的抗菌藥物敏感試驗顯示，GBS對青霉素G、替加環素和利奈唑胺的敏感性為100.0%；對氨芐西林和萬古霉素的敏感性較高，分別為97.0%和93.9%；對氯潔霉素和四環素的敏感性較低，分別為39.4%和24.2%。GBS對克林霉素、喹諾酮類、氯潔霉素和四環素的耐藥率較高，見表1。

3 討論

GBS是導致圍生期感染的重要致病菌[7-8]，西方發達國家對妊娠期GBS感染做了大量研究，美國CDC于1996、2002、2010年先后3次頒布并修訂了圍生期GBS防治指南，推薦對孕35～37周的孕婦常規開展GBS篩查[6]。國內報道圍生期GBS的感染率為10.1%～32.4%[9-11]，差異較大，這與我國未全面開展孕婦GBS的篩查以及GBS檢測方法、試劑和診斷標準的不統一有關。本研究發現妊娠晚期孕婦生殖道GBS定植率為10.7%，與前人的研究相近，但仍有待大樣本、多中心的研究進一步了解我國妊娠期婦女GBS感染的現狀。

表1 33例GBS菌株對抗菌藥物的耐藥分析[例（%）]

目前常用的GBS檢測方法有細菌培養、PCR、核酸探針檢測、免疫原位雜交等。細菌培養法是檢測GBS感染的金標準，也是國內大多數醫院首選的檢測方法。但是細菌培養一般需24～48h，耗時長[12]，對于早產、胎膜早破以及未正規產前檢查的孕婦，可能由于檢測時效問題，以致用藥不及時，造成新生兒感染的風險增加。此外，細菌培養法檢出率低[13]，可能受到多種因素影響：（1）陰道和直腸的其他細菌生長抑制GBS的繁殖，導致細菌量不足，使得培養難度增加，甚至出現假陰性的結果；（2）標本取材后受保存條件、環境溫度等因素的影響，GBS有部分死亡的可能，從而出現漏診現象。應用PCR技術來檢測GBS是近年來的研究熱門，其優點是快速、敏感、可批量操作，核酸提取后只需2～4h便能得到檢測結果，并且可以檢測到死亡的GBS[14]，實現了GBS的快速高效篩查。有研究報道細菌培養法的陽性率只有 5.2%、7.5%[15-16]，而 PCR 法敏感性為 85.0%～98.5%[17]。本研究對標本的采集、運輸、檢驗工作展開嚴格質控，標本采集人員均通過嚴格培訓，標本采集后及時送檢，結果顯示細菌培養法檢出率仍偏低，僅為3.4%，而FQ-PCR法檢出率高達10.7%，提示FQ-PCR法具有更高的靈敏度、特異度，這也是對篩查方法的基本要求。因此，FQPCR法有望成為今后妊娠晚期GBS的常規檢測方法。

對GBS攜帶孕婦采取積極有效的預防和治療措施，可治療圍生期孕婦感染，減少新生兒感染并降低新生兒死亡率[18]。CDC推薦對有高危因素或篩查陽性者產程中預防性使用抗生素(intrapartom antibiotic prophylaxis，IAP)，可有效降低圍生期感染[19]。IAP首選藥物為青霉素G，有青霉素過敏史但非速發型超敏反應者可選用頭孢唑啉，對青霉素過敏且為速發型超敏反應者選擇克林霉素，若克林霉素耐藥，改用萬古霉素[6]。隨著IAP的實施，圍生期GBS感染的發生率和危害大幅降低，但是抗生素的過度使用，帶來了GBS的耐藥問題。近年Lu等[20]對北京地區孕婦定植GBS菌株的耐藥情況展開研究，發現克林霉素耐藥率高達55.7%，國內其他地區文獻報道GBS對克林霉素的耐藥率范圍為26.7%～83.7%[21-23]。我國GBS克林霉素耐藥現象嚴峻，其作為青霉素過敏孕婦的IAP替代方案值得商榷。本研究33例細菌培養陽性的GBS藥敏結果顯示，13種抗菌藥物耐藥率為0.0%～63.7%，其中四環素的耐藥率最高，為63.7%，克林霉素的耐藥率為24.3%，低于Lu等[20]的報道，這可能與本研究樣本量小，細菌培養陽性率低，或地域差異有關。近年來多項研究證明GBS對青霉素仍保持高度敏感，Wang等[24]研究中GBS菌株對青霉素全部敏感。本研究發現GBS對青霉素G的敏感性為100.0%，與國內相關研究一致，提示青霉素仍可作為GBS感染IAP的首選藥物。

綜上所述，妊娠晚期GBS感染可造成多重不良妊娠結局，目前已引起圍生醫學界的高度重視。應用FQPCR法能夠提高GBS的陽性檢出率，具有速度快、靈敏度高的特點，顯著優于傳統的細菌培養法，值得臨床推廣應用。對GBS感染者實行IAP，有助于改善妊娠結局及新生兒預后，然而GBS的耐藥問題日益嚴峻，尋找GBS感染的危險因素和有效預防方法是今后重要的研究方向，有利于規范我國妊娠期GBS感染的篩查和防治策略。

[1]Boyer KM,Gadzala CA,Kelly PD,et al.Selective intrapartum chemoprophylaxis of neonatal group B streptococcal early-onset disease.II.Predictive value of prenatal cultures[J].The Journal of Infectious Diseases,1983,148(5):802-809.

[2]王茜,馬良坤,宋英娜,等.妊娠晚期B族鏈球菌感染的篩查方法及妊娠結局分析[J].中華醫學雜志,2016,96(15):1188-1191.doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.15.009.

[3]陳紅波,孟祥蓮,王謝桐.圍生期B族鏈球菌感染的研究現狀[J].現代婦產科進展,2015,2:149-151.doi:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2015.02.023.

[4]Heath PT.Status of vaccine research and development of vaccines for GBS[J].Vaccine,2016,34(26):2876-2879.doi:10.1016/j.vaccine.2015.12.072.

[5]Kessous R,Weintraub AY,Sergienko R,et al.Bacteruria with group-B streptococcus:is it a risk factor for adverse pregnancy outcomes?[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2012,25(10):1983-1986.doi:10.3109/14767058.2012.671872.

[6]Verani JR,McGee L,Schrag SJ.Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC,2010[J].MMWR Recomm Rep,2010,59(RR-10):1-36.

[7]蘇良香,裴美蘭,張建平,等.B族溶血性鏈球菌感染與胎膜早破及早產的關系[J].檢驗醫學,2007,22(6):728-729.doi:10.3969/j.issn.1673-8640.2007.06.024.

[8]米陽,王艷霞,郭娜,等.孕婦生殖道B族鏈球菌感染對母兒預后的影響研究[J].中國婦幼保健,2015,30(7):1065-1066.doi:10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2015.07.31.

[9]馬延敏,吳連方,黃醒華.孕婦B族溶血性鏈球菌帶菌與母嬰預后的關系[J].中華婦產科雜志,2000,35(1):32-35.doi:10.3760/j.issn.0529-567X.2000.01.010.

[10]趙蓮.產前陰道內B族鏈球菌攜帶對母兒的影響[J].首都醫科大學學報,1999,20(4):285-286.doi:10.3969/j.issn.1006-7795.1999.04.017.

[11]梁梅英,王山米.產前B族鏈球菌感染對母兒的影響[J].中華圍產醫學雜志,1999,2(1):12-14.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.1999.01.005.

[12]王麗,葉巍,馬杰.實時熒光PCR技術和細菌培養法檢測妊娠晚期孕婦定植B群鏈球菌臨床分析[J].國際檢驗醫學雜志,2014,16:2220-2221.doi:10.3969/j.issn.1673-4130.2014.16.043.

[13]陳小平,王惠姣,俞北偉,等.B族鏈球菌產前篩查在母嬰感染防控中的應用[J].檢驗醫學,2016,31(4):266-269.

[14]時春艷,趙揚玉,范玲,等.實時聚合酶鏈反應技術檢測妊娠晚期孕婦B族溶血性鏈球菌的多中心研究[J].中華圍產醫學雜志,2014,17(6):361-364.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2014.06.004.

[15]劉睿,崔坤友,劉文彬,等.應用熒光PCR技術和細菌培養法檢測孕婦產前B族鏈球菌感染的對比分析[J].醫藥前沿,2014,8:198-199.doi:10.3969/j.issn.2095-1752.2014.08.184.

[16]何國才,白清,李高,等.桂林地區孕晚期孕婦B族鏈球菌檢測及藥敏分析[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(15):2006-2007.doi:10.3969/j.issn.1673-4130.2013.15.040.

[17]Abdelazim IA.Intrapartum polymerase chain reaction for detection of group B streptococcus colonisation[J].The Australian&New Zealand journal of obstetrics&gynaecology,2013,53(3):236-242.doi:10.1111/ajo.12030.

[18]鮑蘇青,劉小媚,王青.孕婦生殖道B族鏈球菌感染對母嬰預后影響的臨床研究[J].中華醫院感染學雜志,2015,2:430-432.doi:10.11816/cn.ni.2015-135618.

[19]Stoll BJ,Hansen NI,Sánchez PJ,et al.Early onset neonatal sepsis:the burden of group B Streptococcaland E.coli disease continues[J].Pediatrics,2011,127(5):817-826.doi:10.1542/peds.2010-2217.

[20]Lu B,Li D,Cui Y,et al.Epidemiology of Group B streptococcus isolated from pregnant women in Beijing,China[J].Clin MicrobiolInfect,2014,20(6):370-373.doi:10.1111/1469-0691.12416.

[21]徐水清,周俊,王先利.孕婦泌尿生殖道無乳鏈球菌感染的耐藥性分析 [J].中華醫院感染學雜志,2015,16:3788-3789,3807.doi:10.11816/cn.ni.2015-142159.

[22]伍婷婷,閔小春,王威.臨床患者感染無乳鏈球菌分離株的耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2015,1:43-45.doi:10.11816/cn.ni.2015-131516.

[23]林宇嵐,陳守濤,荀振,等.179株無乳鏈球菌的標本分布及耐藥性分析[J].國際檢驗醫學雜志,2015,10:1376-1378.doi:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.10.024.

[24]Wang P,Tong JJ,Ma XH,et al.Serotypes,antibiotic susceptibilities,and multi-locus sequence type profiles of Streptococcus agalactiae isolates circulating in Beijing,China[J].PLoS One,2015,10(3):e0120035.doi:10.1371/journal.pone.0120035.eCollection 2015.