黃體酮聯(lián)合主動免疫治療對復(fù)發(fā)流產(chǎn)相關(guān)因子的研究

曹井賀，楊愛軍，位玲霞

(濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山東 濟寧 272000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指臨床上在1年內(nèi)反復(fù)流產(chǎn)次數(shù)大于等于2次，且妊娠周數(shù)不超過20周，臨床上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生率可達0.6%左右[1-2]。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者中，仍然存在40%～50%的患者無明顯的病因[3]。原因不明的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可以導(dǎo)致患者不全流產(chǎn)、人工流產(chǎn)次數(shù)的上升，特別是人工流產(chǎn)過程中的反復(fù)機械性損傷操作，可以增加患者遠期并發(fā)癥的發(fā)生。對于原因不明的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療，可以改善患者妊娠結(jié)局，并降低多次人工流產(chǎn)導(dǎo)致的宮腔粘連等并發(fā)癥的發(fā)生[4]。淋巴細(xì)胞主動免疫治療在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者中具有一定的治療效果，其可以通過改善母體與胚囊的免疫耐受、提高封閉抗體的濃度，進而維持妊娠狀態(tài)[5-6]。本次研究重在探討常規(guī)的黃體酮保胎治療聯(lián)合淋巴細(xì)胞免疫治療的臨床效果，進一步指導(dǎo)臨床診療，研究報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年6月至2014年6月濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的174例原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者采用隨機數(shù)字表分為試驗組、對照組各87例。試驗組87例患者，年齡24～38歲，平均年齡29.94±5.61歲，既往自然流產(chǎn)次數(shù)3～7次，平均4.9±0.8次。對照組87例患者，年齡23～38歲，平均年齡29.45±6.06歲，既往自然流產(chǎn)次數(shù)3～8次，平均5.1±0.9次。兩組患者的上述資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)

①入院檢查患者排卵正常，月經(jīng)周期、月經(jīng)量均正常；②患者既往出現(xiàn)連續(xù)3次或3次以上的自然流產(chǎn)；③患者年齡20～39歲；④治療前與患者簽署知情同意書，同時報本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并生殖系統(tǒng)疾病、器質(zhì)性病變的患者；②合并自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病的患者；③染色體異常的患者；④對本研究治療方法嚴(yán)重不耐受的患者。

1.4 治療方法

對照組采用黃體酮針(國藥準(zhǔn)字：H20048596)，20mg，肌肉注射，每日1次，連續(xù)治療至妊娠12周末；觀察組在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用淋巴細(xì)胞免疫治療，采集靜脈血30mL，進行常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離，制備磷酸鹽緩沖液，加入去離子水500mL混勻，加入碳酸氫鈉調(diào)整pH值至7.4，并最終定容至1L，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)緩沖液洗滌3次，每次5min，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1×107/mL～5×107/mL，吸取0.5mL的淋巴細(xì)胞懸浮液于妊娠者前壁皮內(nèi)5點注射，每次間隔3周，注射2次后鼓勵患者妊娠，妊娠后再注射2次。

1.5療效評價

以妊娠成功分娩活胎作為治療成功的標(biāo)準(zhǔn)；檢測并比較兩組患者治療前、治療結(jié)束后的血清細(xì)胞因子：干擾素-γ(interferon-r，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)以及調(diào)節(jié)蛋白(regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)因子的變化情況；對比兩組患者治療第1個療程、第2個療程的封閉抗體(blocking antibodies，BA)陽轉(zhuǎn)率。

清晨采集空腹靜脈血(第二次采血在治療后的24～48h)，分離血清后，-20℃保存待測，采集標(biāo)本后1周內(nèi)檢測RANTES、BA抗體，相關(guān)指標(biāo)測定采用電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(美國雅培i2000)，檢測試劑盒購自福建新大陸生物技術(shù)有限公司。具體檢測方法參照試劑盒說明書，試劑盒內(nèi)配有質(zhì)控血清或質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，所有操作嚴(yán)格按照操作說明完成。

采集靜脈血后1 000r/min(離心半徑為15cm)，獲得血清后抽取50μL樣品加入96孔板內(nèi)，采用去離子水作為陰性對照，采用50μL cryab作為陽性對照，平衡搖晃20s混勻，室溫下孵育2h，采用TBSP緩沖液清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡搖晃30～45s，25℃室溫下孵育40min，加入250μL終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后已空白對照為基準(zhǔn)，采用分光光度計進行讀數(shù)。IFN-γ、IL-8、IL-4抗體購自羅氏檢測公司，相關(guān)配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書的要求進行操作。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患者治療前后血清細(xì)胞因子水平比較

治療前，試驗組和對照組患者血清IFN-γ、IL-8、IL-4、RANTES因子水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；治療后，兩組患者的血清IFN-γ水平較治療前顯著降低(P<0.05)，IL-8、IL-4、RANTES因子較治療前顯著提高(均P<0.05)；治療后，試驗組患者的血清IFN-γ水平顯著低于對照組(t=6.268，P<0.05)，IL-8、IL-4、RANTES因子顯著高于對照組(t值分別為5.336，6.137，4.210，均P<0.05)，見表1。

項目試驗組(n=87)對照組(n=87)tPIFN-γ(ng/L) 治療前349.80±58.12 360.14±67.54 1.0790.282 治療后264.96±47.21*#311.52±50.85*6.2680.000t7.2964.317P0.0000.000RANTES(ng/L) 治療前228.75±114.06233.53±109.270.2840.777 治療后429.63±127.58*#351.81±116.04*4.2100.000t9.1085.728P0.0000.000IL-4(pg/mL) 治療前56.11±2.2355.80±1.820.9840.326 治療后62.05±2.84*#59.34±3.06*6.1370.000t12.0478.556P0.0000.000IL-8(pg/mL) 治療前316.33±98.57 330.12±101.850.9090.365 治療后588.27±127.06*#489.54±116.81*5.3360.000t7.1654.085P0.0000.000

注：*為與治療前比較，#為與對照組治療后比較。

2.2兩組患者治療后BA陽轉(zhuǎn)率比較

治療1個療程、2個療程試驗組的BA陽轉(zhuǎn)率均顯著高于對照組患者(均P<0.05)，見表2。

表2兩組患者治療后BA陽轉(zhuǎn)率比較[n(%)]

Table 2 Comparison of BA positive conversion rate of patients between two groups after treatment [n(%)]

2.3兩組患者治療后妊娠情況

試驗組的成功妊娠率、活胎分娩率均顯著高于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3兩組患者治療后妊娠情況[n(%)]

Table 3 Pregnancy results of patients between two groups after treatment [n(%)]

3討論

3.1復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的背景研究及發(fā)病機制分析

近年來原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病率呈現(xiàn)出了明顯上升的趨勢，特別是在年齡25～35歲的人群中，其發(fā)病率更高。反復(fù)的流產(chǎn)不僅導(dǎo)致妊娠失敗，同時可以促進宮腔粘連、功能性子宮出血、不孕及慢性盆腔炎癥性疾病等的發(fā)生，臨床預(yù)后不佳。對于其病因的探討雖然迄今無明確的研究證實，但一般認(rèn)為其發(fā)病可能與免疫耐受的異常有關(guān)[7]。不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者，其配偶的白細(xì)胞表面抗原或者染色體遺傳抗原表位的相似度較高，精子中的父系遺傳表位難以通過刺激母系的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，特別是封閉抗體的產(chǎn)物不足，導(dǎo)致受精卵在妊娠早期容易受到T淋巴細(xì)胞的殺傷作用而流產(chǎn)。另外，細(xì)胞炎癥因子在介導(dǎo)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞免疫的過程中發(fā)揮了重要的作用。IFN-γ可以通過提高樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的抗原提呈效應(yīng)，介導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，促進胚囊滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡和新生血管的萎縮[5]；而IL可以發(fā)揮不同的效應(yīng)，血清中IL-4、IL-8對于Th2細(xì)胞的激活作用可以參與到Th1/Th2淋巴細(xì)胞免疫的平衡過程中，抑制Th1/Th2平衡的左移導(dǎo)致的細(xì)胞免疫的激活，紊亂T淋巴細(xì)胞免疫，提高免疫耐受效果[6]。

3.2淋巴細(xì)胞主動免疫治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機制

淋巴細(xì)胞主動免疫治療是通過父系的外周血淋巴細(xì)胞的提取，注射入母體后誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的封閉型抗體，并提高免疫耐受程度，減輕胚胎發(fā)育過程中的免疫紊亂、IFN-γ損傷等導(dǎo)致的流產(chǎn)的發(fā)生。已有的研究表明，淋巴細(xì)胞主動免疫治療可以提高不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的妊娠結(jié)局，提高活胎分娩比例[6]，但對于此過程中的RANTES、IFN-γ、IL-8、IL-4等的研究不足，此為本次研究的創(chuàng)新性所在。

3.3黃體酮聯(lián)合主動免疫治療對復(fù)發(fā)流產(chǎn)的臨床效果

封閉抗體(BA)是胚囊發(fā)育的保護性抗體，可以起到屏障性的作用，本次研究中兩組患者治療后的BA抗體的陽性率均明顯上升，其中觀察組在治療1個療程及2個療程后的BA陽性率均明顯高于對照組，表明淋巴細(xì)胞免疫治療可以提高BA的含量。注入母體中的淋巴細(xì)胞表面含有多種糖蛋白類分子，可以通過刺激漿細(xì)胞及B細(xì)胞分泌BA抗體，而循環(huán)血中上升的BA抗體可以抑制T淋巴細(xì)胞過度活化導(dǎo)致的胚囊的損傷。苗竹林等[8]研究者通過回顧性分析了74例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)在主動免疫治療的患者中，BA的平均陽性率可達70%以上，這與本次研究的結(jié)論較為一致，同時認(rèn)為BA陽性率每上升20%，成功妊娠率可上升5%，臨床預(yù)后明顯改善。IFN-γ可以誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞激活，促進滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，本研究中觀察組治療后的IFN-γ下降更為明顯，IFN-γ對于胚囊的損傷作用減輕；IL-8、IL-4、RANTES可以穩(wěn)定Th1/Th2T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)的平衡，抑制免疫過度應(yīng)答，特別是RANTES可以結(jié)合CD8+T淋巴細(xì)胞膜上的糖蛋白結(jié)合位點，減輕抗原刺激導(dǎo)致的排斥反應(yīng)，本研究中治療后的IL-8、IL-4、RANTES因子顯著的高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)細(xì)胞因子的上升可以改善母體免疫系統(tǒng)、提高母胎界面的封閉效率。對照組的受孕率較低，這主要考慮與入組患者的既往宮腔操作病史或者慢性盆腔炎癥性疾病病史等有關(guān)，但也考慮與本次研究的樣本量的總體代表性不足等有關(guān)。對于妊娠結(jié)局的分析可以發(fā)現(xiàn)，觀察組的成功妊娠率及遠期活胎分娩率均明顯上升，妊娠結(jié)局的改善較為明顯。

綜上所述，淋巴細(xì)胞免疫治療可以提高封閉抗體的陽性率，改善血清IFN-γ、IL-8、IL-4、RANTES等細(xì)胞因子水平，進而改善妊娠結(jié)局。后續(xù)研究可以增加樣本量，進一步探討淋巴細(xì)胞主動免疫治療對于患者遠期妊娠結(jié)局的分析。

[參考文獻]

[1]Martínez-Ruiz A, Sarabia-Meseguer M D, Pérez-Fornieles J,etal. Placental growth factor, soluble fms-like tyrosine kinase 1 and progesterone as diagnostic biomarkers for ectopic pregnancy and missed abortion[J].Clin Biochem,2014,47(9):844-847.

[2]Coomarasamy A, Williams H, Truchanowicz E,etal. PROMISE: first-trimester progesterone therapy in women with a history of unexplained recurrent miscarriages-a randomised, double-blind, placebo-controlled, international multicentre trial and economic evaluation[J]. Health Technol Assess,2016,20(41):1-92.

[3]叢林,劉長明,朱立新,等.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者淋巴細(xì)胞主動免疫治療前后細(xì)胞亞群的變化[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2012,28(5):378-380.

[4]孫莉,梁磊,楊波.主動聯(lián)合被動免疫療法治療封閉抗體陰性孕婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)臨床觀察[J].山東醫(yī)藥,2015,55(43):44-45.

[5]Osmanagaoglu M A, Karahan S C, Aran T,etal. The diagnostic value of β-human chorionic gonadotropin, progesterone, and ischemia-modified albumin and their combined use in the prediction of first trimester abortions[J]. Int Sch Res Notices,2014,2014:846531.

[6]Liu Z, Xu H, Kang X,etal. Allogenic lymphocyte immunotherapy for unexplained recurrent spontaneous abortion: a meta-analysis[J]. Am J Reprod Immunol,2016,76(6):443-453.

[7]楊素娟,趙志明,王瑋,等.主動免疫治療原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)1005例療效評價[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2016,32(4):311-313.

[8]崔蓉, 鐘興明, 苗竹林,等. 精子DNA完整性對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2017, 28(12):2034-2036.