尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠生存質量及TGF?β1/Smad通路表達的影響

程錦繡 郝軍榮 王琳琳 劉翠蘭 潘星 劉圣君 劉華

1河北北方學院附屬第一醫院腎內科（河北張家口 075000）；2河北北方學院藥理教研室（河北張家口 075000）

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠，SPF級，40只，體質量180 g左右，購自于河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（冀）2003-1-003。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑尿毒清顆粒［康臣藥業（內蒙古）有限責任公司，國藥準字Z20073256，商品規格：5 g×18袋］；4.25%葡萄糖腹膜透析液（廣州百特醫療用品有限公司，生產批號：國藥準字H20133286）；腺嘌呤（合肥博美生物科技有限責任公司）；兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗體、免疫組化專用濕盒（博士德生物制品有限公司提供）；山羊抗大鼠磷酸化Samd2/3多克隆抗體（美國Sigma公司生產）。

1.2.2 儀器全自動生化分析儀（購自日本日立公司）；精密電子天平（購自上海巴玖實業有限公司）；圖像處理分析系統（北京久易科儀科技有限公司提供）；高清數碼相機（日本索尼公司提供）；自主活動測定儀（上海康為醫療科技發展有限公司）；一次性注射器；灌胃管等。

1.3 模型構建［8］將30只雄性SD大鼠適應性飼養1周后，喂養含0.5%的腺嘌呤飼料構建慢性腎衰竭大鼠模型，喂養10周后檢測血肌酐、尿素氮水平，查看是否達到慢性腎衰竭標準。后腹腔內插入腹透管，每日腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液，行腹膜透析構建腹膜透析大鼠模型。放置腹透管后，用肝素進行沖洗，若腹透管通暢，則造模成功。

1.4 分組與給藥將造模成功大鼠隨機分為3組，即模型組（M組）、低劑量試驗組（L組）、高劑量試驗組（H組）。L組大鼠給予尿毒清顆粒2 g/（kg·d）灌胃處理；H組大鼠給予尿毒清顆粒4 g/（kg·d）灌胃處理；正常組（N組）及M組大鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃處理。

1.5 檢測指標每隔3周對4組大鼠進行稱重，觀察其自主活動次數并記錄；于飼養12周末，抽取4組大鼠空腹靜脈血，利用日本日立公司生產的全自動生化分析儀檢查血清血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；同時，斷頭處死大鼠，解剖其腹部，剝離腎臟組織，進行稱重并計算腎臟肥大指數（SW/BW，雙腎均重/體重）；將稱重后的腎組織進行免疫組化檢測，用高清數碼相機對轉化生長因子β1（TGF?β1）及磷酸化Samd2/3蛋白結果拍照，并通過圖像處理系統分析圖片的積分光密度（IOD）。

1.6 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件對實驗數據進行分析，計數資料用頻數、構成比表示；計量資料采用形式表示，組間比較采用單因素方差分析，后續組間兩兩比較采用LSD?t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

To increase the output power of the GaSb based SDLs, different methods have been investigated, such as epitaxial growth optimization, lateral lasing suppression, multiple gain elements and effective thermal management.

2 結果

2.1 尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠體質量的影響0～4周，4組大鼠體質量均有不同程度升高趨勢，其增長速度為：N組＞H組＞L組＞M組；4～8周時，雖體質量均有增長，但增長速度有所變化，其原因可能是個別組大鼠死亡，亦或是其余大鼠體質量波動范圍較大；隨時間推移，8～12周時，體質量增長情況為：N組＞H組＞L組＞M組。見圖1。

圖1 4組大鼠體質量變化曲線Fig.1 Curve of body mass change in four groups of rats

2.2 尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠自主活動次數的影響于4周前，各組大鼠自主活動次數均有不同程度下降（正常組除外），其原因可能是由于模型制備；隨時間推移，4～8周期間，M組大鼠自主活動次數減少最快，與L組、H組大鼠相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。8～12周時，M組大鼠自主活動次數迅速下降，與其余3組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠Scr、BUN及SW/BW的影響經統計分析可知，4組大鼠12周末血Scr、BUN及腎臟肥大指數比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。L組、H組大鼠血Scr水平與M組相比均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），H組大鼠血Scr與L組對比變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）；與M組對比，L組、H組大鼠血BUN水平均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），H組大鼠血BUN與L組對比，差異無統計學意義（P＞0.05）；與M組對比，L組、H組大鼠腎臟肥大指數均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），H組大鼠腎臟肥大指數同L組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖2 四組大鼠自主活動次數變化曲線Fig.2 Change curve of autonomic activity in four groups of rats

表1 4組大鼠Scr、BUN及SW/BW比較Tab.1 Comparison of Scr，BUN and SW/BW in the blood of four groups of rats（n=10） x± s

2.4 尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠腎組織中TGF?β1、p?Samd2/3的影響TGF?β1、p?Samd2/3在正常大鼠腎臟中表達含量極低。經尿毒清顆粒干預后，L組、H組大鼠腎臟TGF?β1、p?Samd2/3表達均下降，與M組對比，差異有統計學意義（P＜0.05），且L組與H組組間對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

腹膜透析是救治急、慢性腎功能衰竭的有效治療方式，其原理是使體液內的成分（溶質或水分）通過半透膜排出體外，達到腎臟替代或支持治療的目的［9-10］。有研究表明［11］，腹膜透析大鼠腹膜間細胞代償性過度增生，且隨病情進展腹膜間皮細胞出現衰亡、脫落及血管新生等情況。本文通過構建慢性腎衰竭腹膜透析大鼠模型，將體質量、自主活動次數、腎臟肥大指數作為生存質量評估指標，研究尿毒清顆粒對慢性腎衰竭腹膜透析大鼠生存質量及TGF?β1/Smad通路表達的影響，以期更好應用于臨床。

表2 4組大鼠腎組織中TGF?β1、p?Samd2/3免疫組化圖片IOD比較Tab.2 Comparison of immunohistochemical images of TGF?beta 1 and p?Samd2/3 in four groups of rats′renal tissue（n=10）±s

表2 4組大鼠腎組織中TGF?β1、p?Samd2/3免疫組化圖片IOD比較Tab.2 Comparison of immunohistochemical images of TGF?beta 1 and p?Samd2/3 in four groups of rats′renal tissue（n=10）±s

注：同N組對比，*P＜0.05;同M組對比，△P＜0.05；同L組對比，▼P＜0.05

組別N組M組L組H組TGF?β1 7.46±4.06 81.97±20.87*56.56±16.89*△33.57 ± 12.11*△▼p?Samd2/3 1.32±0.46 56.22±13.17*39.07±9.79*△24.12 ± 6.85*△▼

觀察實驗結果，可知4組大鼠體質量均有不同程度升高趨勢，但增長速度不同；除正常組外，4周前，各組大鼠自主活動次數均有不同程度下降；隨時間推移，4～12周期間，模型組大鼠自主活動次數最早降低且降低最快，較低、高劑量試驗組大鼠差異明顯；出現以上結果，其原因可能是病情進展或藥物干預作用。與模型組比較，低、高劑量試驗組大鼠血肌酐、尿素氮及腎臟肥大指數均明顯降低，與低劑量試驗組比較，高劑量試驗組大鼠變化不明顯。TGF?β1/Samd信號通路介導腎小管上皮細胞轉化為間充質細胞及腎纖維化［12］。TGF?β1具有調節細胞生長和分化的作用，與纖維化密切相關［13］。Smad蛋白是位于TGF?β1下游的調節信號蛋白，磷酸化Smad2/3蛋白反映TGF?β1的激活水平［14-15］。本研究中，TGF?β1、p?Samd2/3在正常大鼠腎臟中表達含量極低。經尿毒清顆粒干預后，低、高劑量試驗組大鼠腎臟TGF?β1、p?Samd2/3表達量均下降，且兩組間比較，差異有統計學意義。

本研究應用尿毒清顆粒治療慢性腎衰竭大鼠，通過觀察大鼠血肌酐、尿素氮、腎臟TGF?β1、p?Samd2/3水平及大鼠腫瘤體積的情況，探討了TGF?β1/Smad通路影響腹膜纖維化的機制，得出尿毒清顆粒治療慢性腎衰竭的機制，為臨床應用提供參考依據。本研究不完善之處在于需要觀察大鼠生存質量所以無法處死獲得病理切片，而且此實驗為短期研究，需要設計長期試驗觀察尿毒清顆粒對腹膜纖維化的長期作用，Smsd蛋白為TGF?β1下游信號通路，其他信號通路是否參與此過程仍需進一步試驗驗證。

綜上所述，尿毒清顆粒可提高慢性腎衰竭腹膜透析大鼠生存質量，降低血肌酐、尿素氮水平，其機制可能與調節TGF?β1/Smad通路有關。

［1］BORISOV V V，SHILOV E M.Chronic renal failure［J］.Child Nephrol Urol，2017，33（10）：121?184.

［2］CHIU H H L，TANGRI N，DJURDJEV O，et al.Perceptions of prognostic risks in chronic kidney disease：a national survey［J］.Can J Kidney Health Dis，2015，2（1）：1?8.

［3］JING X G，NEPHROLOGY D O.Clinical effect of peritoneal dialysis combined with hemodialysis in the treatment of chronic renal failure［J］.Clin Res Pract，2017，2（16）：20?21.

［4］ZHOU Q，BAJO M A，PESO G D，et al.Preventing peritoneal membrane fibrosis in peritoneal dialysis patients［J］.Kidney Int，2016，90（3）：515?524.

［5］LU Y，GAO L，LI L，et al.Hydrogen sulfide alleviates perito?neal fibrosis via attenuating inflammation and TGF?β1 synthesis［J］.Nephron，2015，131（3）：210?219.

［6］何玉明，丁憲群.尿毒清顆粒對早中期糖尿病腎病患者炎癥因子影響的臨床研究［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（6）：160?162.

［7］門雯瑾，丁致民.尿毒清顆粒對慢性腎功能衰竭患者腎功能和微炎癥的影響［J］.臨床內科雜志，2016，33（3）：201?202.

［8］衛志鋒，陸繼芳，劉圣君，等.甘草酸二胺對腹膜透析模型大鼠腹膜功能的保護作用研究［J］.疑難病雜志，2017，16（4）：385?388+320.

［9］侯秀鳳，宋華.慢性腎功能衰竭患者腹膜透析置管術的圍手術期護理［J］.中國實用護理雜志，2012，28（3）：15?16.

［10］李蓮葉，張琳琪，曲斌.兒童急性腎功能衰竭行腹膜透析的護理進展［J］.中華護理雜志，2016，51（5）：618?621.

［11］衛志鋒，陸繼芳，劉圣君，等.甘草酸二胺對腹膜透析模型大鼠腹膜功能的保護作用研究［J］.疑難病雜志，2017，16（4）：385?388.

［12］林琳，鄭晶，朱偉平.ILK介導TGF?β/Smad通路誘導腎小球內皮細胞?間充質細胞轉分化的研究［J］.重慶醫學，2015，44（28）：3911?3914.

［13］周竹，陳金.Cthrc1及tgf?β1/Smad與異常纖維化關系的研究進展［J］.實用醫院臨床雜志，2014，11（2）：188?191.

［14］ZHOU Q，ZHENG X，CHEN L，et al.Smad2/3/4 pathway con?tributes to TGF?β?Induced MiRNA?181b expression to promote gastric cancer metastasis by targeting Timp3［J］.Cell Physiol Biochem，2016，39（2）：453?466.

［15］TANG Y N，DING W Q，GUO X J，et al.Epigenetic regula?tion of Smad2 and Smad3 by profilin?2 promotes lung cancer growth and metastasis［J］.Nat Commun，2015，6：8230.