谷子穗頂端敗育突變體sipaa1的表型分析和基因定位

薛紅麗，楊軍軍，湯沙，智慧，王蕊，賈冠清，喬治軍，刁現民

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谷子穗頂端敗育突變體的表型分析和基因定位

薛紅麗1,2，楊軍軍2，湯沙2，智慧2，王蕊2，賈冠清2，喬治軍3，刁現民2

（1山西大學生物工程學院，太原 030006；2中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3山西農業科學院品種資源研究所，太原 030031）

【目的】穗發育對于農作物產量至關重要，而穗頂端敗育是谷子產量下降的重要原因之一。通過挖掘谷子穗頂端敗育的相關基因，探求谷子穗頂端發育的生物學通路，以期為谷子穗發育遺傳機理研究提供理論基礎。【方法】利用化學誘變劑甲基硫酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）對野生型豫谷一號（Yugu1）進行誘變，在其后代中發現了一個可以穩定遺傳的穗頂端敗育的突變體，命名為同時對該突變體的農藝性狀進行鑒定。以突變體母本，SSR41父本構建的F2定位群體為材料進行遺傳分析及圖位克隆，確定基因所屬染色體以及在該染色體上的位置。對突變體和野生型Yugu1的BC1F2進行高通量測序，挖掘定位區間內的候選基因，根據候選基因在谷子不同組織部位表達量的差異，找出在穗部高表達的候選基因。對孕穗期的Yugu1和進行轉錄組測序，尋找差異表達基因并分析差異表達基因富集的生物學通路。【結果】與Yugu1相比，突變體的平均株高略有增高，增幅不顯著，葉長、葉寬分別降低了10.66%和5.08%。突變體的表型變異主要集中在穗部，最突出的表現是穗頂端小花發育異常，谷穗長和谷穗粗分別降低了11.36%和16.12%，單株穗重、谷碼數、單穗粒重及千粒重分別降低了30.02%、32.58%、30.55%和18.18%。通過對×SSR41的F2代群體中正常株與突變株的遺傳分析表明該突變為隱性單基因控制。經圖位克隆將突變基因定位于第1染色體Indel標記1-9.23與1-9.333之間約100 kb的范圍內。結合高通量測序數據庫，在該定位區間篩選到6個在穗部高表達的候選基因。轉錄組測序發現，在突變體與野生型之間存在2 768個上調表達基因，507個下調表達基因，且定位區間內有2個差異表達基因主要與激素信號轉導、外界脅迫響應、植物-病原互作等生物學通路有關。【結論】谷子穗頂端敗育突變體由隱性單基因控制,突變基因位于第1染色體Indel標記1-9.23與1-9.333之間，轉錄組測序與基因功能分析發現了2個在穗部高表達且與植物花器官發育及脅迫響應密切相關的候選基因，候選基因可能通過對激素、脅迫響應，以及細胞程序性死亡等相關通路調控谷子穗頂端敗育。

谷子；穗頂端敗育；表型分析；基因定位；轉錄組測序

0 引言

【研究意義】伴隨著耕地面積的不斷減少和人口基數的不斷壯大，糧食短缺已成為制約中國生態與經濟快速發展的重要因素，在水資源嚴重缺乏的干旱與半干旱地區形勢更為嚴峻[1-3]，高產育種是解決當前中國糧食短缺的重要途徑。谷子是起源于中國的古老栽培作物之一，同時也是中國北方重要的糧食作物[4-6]。谷子營養價值豐富，具有適應性廣、抗逆性強、耐旱、耐瘠薄等特點，是區域糧食安全的重要保障[6-7]。穗是禾本科作物最重要的生殖器官，也是作物產量的重要來源，因此，穗的發育狀況直接影響糧食作物產量，其中谷穗頂端敗育現象就是一個影響谷子產量的重要農藝性狀。【前人研究進展】作物產量及其構成因子是多基因控制的數量性狀，并受基因型和環境的共同影響。而穗是禾本科作物產量的形成器官，因此，穗頂端敗育是基因與環境互作的結果[8]。禾本科作物穗頂端敗育在玉米中研究較多，且多集中于穗敗育與環境因素以及激素水平、營養供應等生理生化指標的相互關系。相關研究表明，環境因素[9-10]、營養供應[11]、內源激素水平[12-13]等都會影響玉米果穗頂端敗育，但關于穗頂端敗育的遺傳規律和分子基礎的研究較少。孟昭東等[14]發現玉米中禿尖是質量性狀，而禿尖程度是數量性狀。才源[15]發現玉米穗禿尖是由2對顯性基因控制的，穗禿尖長短由2對主效基因和多個微效基因共同調控，通過SSR分子標記技術，將控制玉米果穗敗育的基因定位在玉米第2和第7染色體。McSteen等[16]發現了一個葉腋分生組織缺陷型的突變體（），研究發現突變基因通過編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調節生長素的運輸，最終導致沒有小穗和小花，只有裸露的花序軸的突變體性狀變異。Xiang等[17]發現一個穗發育異常的突變體，該突變體與具有一定的相似性，均表現為株高降低，第一級枝梗和第二級枝梗數減少，谷穗碼數大幅減少等，通過對該突變體進行基因挖掘發現了調控突變體株高、穗型的，該基因在擬南芥過表達轉基因株系中的ABA敏感性以及耐旱性增強[18]。同時，刁現民研究組已經在谷子中構建了以全基因組測序品種Yugu1為遺傳背景且涵蓋了谷子株型、葉色、穗發育以及抗病性等多個農藝性狀的突變體庫，如谷子矮稈突變體[19]、谷子黃綠葉突變體[20]、谷子穗發育異常突變體[21]和[22]、谷子耐旱耐ABA脅迫突變體[23]等，利用這些突變體成功克隆得到了谷子穗花粉發育相關基因、耐逆相關基因、葉色基因等。【本研究切入點】前人關于水稻、玉米中籽粒敗育的研究難以彌補谷子中該研究缺失的空白，同時玉米果穗、稻穗與谷穗有一定的差異，因此，挖掘谷子穗頂端敗育相關基因，探究基因是通過怎樣的生理機制調控穗頂端敗育。【擬解決的關鍵問題】本研究通過圖位克隆方法對突變基因進行基因定位，尋找Yugu1和之間的差異表達基因以及相關生物學通路，找到可能調控穗頂端敗育的基因以及調控穗頂端敗育的相關生物學通路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豫谷一號（Yugu1）是中國華北夏谷區主栽的綜合性狀優良且最有影響的品種，具有豐產、抗病強、耐旱澇、對光溫不敏感、適應性廣等特點，且Yugu1全基因組測序已經完成[24]。利用EMS處理Yugu1，獲得穗頂端敗育突變體，命名為2013年夏，在中國農業科學院作物科學研究所順義試驗站種植突變體（母本），分別與SSR41（父本）、Yugu1（父本）進行雜交。2014年，對突變體與Yugu1雜交得到的F1代在北京順義和海南三亞連續回交兩代獲得BC1F1，2015年對BC1F1連續自交兩代獲得回交測序群體BC1F2。2014年，在中國農業科學院北京順義試驗站種植突變體與SSR41雜交得到的F1代，通過對穗部的觀察篩選出真雜種，再對真雜種植株進行自交，得到F2代種子。2015年，在同一地點種植F2代群體，在抽穗后對穗頂端敗育植株的葉片分單株取樣，即為突變基因定位群體，并統計F2代群體中正常性狀和突變性狀植株的分離比例。所有試驗群體的種植均采用條播法，田間管理按照國家谷子品種區試管理要求進行。

1.2 定位群體葉片樣本的選取

對親本（、SSR41）和F2（×SSR41）群體中的隱性單株葉片進行取樣，從中共收獲592株隱性穗頂端敗育突變體株。

1.3 sipaa1的初步定位

1.3.1 谷子葉片總基因組DNA的提取 采用CTAB法[25]提取谷子葉片基因組總DNA。

1.3.2 篩選多態性Indel標記 利用ZHANG等[26]設計的谷子通用Indel 標記，篩選在正常野生型Yugu1和突變體之間具有多態性的標記。

1.3.3 混池構建 從592份F2（×SSR41）隱性單株中選取30株穗頂端敗育突變體葉片，提取總基因組DNA并檢測其濃度，將其中濃度相近的DNA等量混合均勻（不少于25株），即為定位群體DNA混池。

1.3.4 突變基因初定位 以定位群體DNA混池模板和兩親本間有多態性的Indel標記進行PCR擴增，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定突變基因所處的染色體和上下游Indel標記。在上下游Indel標記范圍內選取更多具有多態性的標記，利用該標記對592份隱性單株葉片DNA進行PCR擴增，擴增產物經過6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經銀染顯色后判斷其帶型。通過對不同Indel標記的重組事件進行統計，確定目標基因所在的精確位置。利用Primer5.0軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見電子附表1。

1.4 農藝性狀調查分析

選取成熟后的野生型Yugu1和突變體各5株，調查其株高、穗長、穗粗、每穗粒數、千粒重等重要農藝性狀。利用Excel軟件整理野生型Yugu1和突變體不同農藝性狀的測量數據，并進行檢驗顯著性分析從而計算出值。在此基礎上利用GraphPad Prism 6.07軟件進行作圖。

1.5 突變體sipaa1的轉錄組測序

利用RNA提取試劑盒（invitrogen）對孕穗期野生型Yugu1與突變體的幼穗進行RNA提取，每個樣品包含3個生物學重復，并交由北京貝瑞和康生物技術有限公司進行轉錄組文庫構建和RNAseq測序工作。RNAseq數據的生物信息學分析通過百邁克云平臺完成（www.biocloud.net）。RNAseq原始數據已經上傳至歐洲生物信息研究所核酸序列數據庫（www.ebi.ac.uk/ena/submit），ID：PRJEB25199（ERP107094）。

2 結果

2.1 突變體sipaa1表型特征及主要農藝性狀分析

與野生型相比，突變體的穗部頂端在穗發育早期就已出現了明顯的敗育現象，一二級枝梗數顯著銳減，花器官異常發育（圖1）。野生型株高139.00 cm，較突變體株高（146.80 cm）略有升高，差異不顯著（圖1-A、圖2-A）；野生型葉長45.33 cm，較突變體（40.50 cm）降低10.66%（圖2-B)；野生型葉寬3.54 mm，較突變體（3.36 mm）降低了5.06%，差異不顯著（圖2-C）。對穗部主要性狀進行統計發現，野生型穗長為23.67 cm，較突變體（20.98 mm）略有降低，二者差異不顯著（圖1-B、圖2-E）；野生型Yugu1穗粗30.64 mm，較突變體（25.70 mm）降低了16.12%（圖1-B、圖2-F）；野生型谷碼數為104.20，較突變體（70.25）減少了32.58%（圖1-D、圖2-H）；野生型千粒重為2.64 g，較突變體（3.12 g）增加18.18%（圖2-J）。總之，與野生型Yugu1相比，突變體的變化主要集中在穗部性狀，如穗粗、碼數、千粒重等，降幅均在10% 以上，而株高、葉寬等性狀則沒有明顯差異。

A：成熟期的植株；B—E：成熟期的穗

A：株高；B：葉長；C：葉寬；D：莖節數；E：穗長；F：穗粗；G：單株穗重；H：谷碼數；I：單穗粒重；J：千粒重

2.2 突變體的突變基因定位

突變體連續多代自交能夠保持穩定遺傳，且×SSR41的子一代（F1）谷穗正常發育，子二代（F2）開始出現性狀分離。經統計發現，F2中出現1 783株正常株，592株突變株，其分離比符合3﹕1，經卡方（χ2）檢驗，χ2=0.0068＜3.841（χ20.05(1)=3.841），表明該突變由隱性單基因控制。

在谷子9條染色體上均勻選取了180對Indel引物，檢測其多態性，最終找到76個可用的Indel標記。利用這76個標記分別擴增父本SSR41、母本和隱性混池DNA，發現在第1染色體上有一個與目標基因緊密連鎖且在父母本間有顯著多態性的Indel標記In1-8.77（圖3、表1）。進一步在In1-8.77標記的上下游尋找標記，最后選出6個可用的多態性標記，分別為In1-6.02、In1-7.35、In1-9.8、In1-10.143、In1-16.2和In1-24.0（表1）。用兩端的標記In1-6.02、In1-24.0以及In1-8.77分別檢測收取的592株突變體葉片的DNA，根據電泳檢測結果，將突變基因定位于Indel 1-8.77與Indel 1-9.8之間。同時將其中顯示H帶（混池DNA既有父本帶又有母本帶）的單株挑選出來，共計80株。

為了進一步縮小區間，在In1-8.77與In1-9.8之間設計20個Indel標記，經檢測發現其中7個標記在父本（SSR41）和母本（）之間有多態性，分別為In1-9.11、Ind1-9.123、Inl1-9.23、In1-9.322、In1-9.333、In1-9.36和In1-9.42。以7對多態性標記進行PCR檢測上述80株隱性突變體單株的帶型，將突變基因定位在In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內（圖3和圖4）。繼續在該范圍內設計多態性引物，結果發現，在592株突變體F2隱性單株后代中沒有了交換株，難以再進一步縮小區間，因此，最終定位目的基因在In1-9.23與In1-9.322區間內。

♂：父本SSR41；♀：母本sipaa1；P：F2隱性單株混池

2.3 突變體sipaa1差異表達基因鑒定

對突變體與野生型Yugu1的轉錄組數據進行了差異表達基因（DEGs，differential expressed genes）鑒定（圖5）。通過統計Mapped Reads在基因組的CDS（編碼區）、5’UTR區（前導序列區）、3’UTR區（尾隨序列區）、Intron（內含子區）、Intergenic（基因間區）等區域的分布分別為79%、3%、13%、2%和3%，大部分的Mapped Reads集中在基因的CDS區（圖5-A），測序結果符合轉錄組特征。圖5-B為突變體和Yugu1各3個生物學重復樣品間的相關性。相關系數的大小代表樣品之間表達模式的相似度。相似度越高（越接近1），樣品之間差異越小；同理，相似度越低（越接近0），樣品之間差異越大。野生型Yugu1 3個重復樣品WT.1、WT.2和WT.3間的相關系數約為0.92，突變體間相關系數約為0.96，說明突變體與野生型的生物學重復樣本之間具有較高的相關性；而突變體與野生型Yugu1的相關系數介于0.78—0.81，即突變體和野生型間的差異顯著，表明RNAseq的樣本選擇合理且試驗數據可重復性及一致性好（圖5-C）。在突變體與野生型Yugu1之間存在3 275個差異基因，上調基因2 768個，上調基因遠多于下調基因（507個），約為其5.5倍（圖5-D）。

表1 部分隱性單株Indel標記檢測結果

S：母本突變體帶型；H：同時具有母本突變體和父本SSR41帶型

S: The strip of mutant; H: The individuals with the strips of parents

2.4 差異表達基因的GO分類與富集分析

將突變體的RNAseq數據與谷子蛋白組進行BLASTP比對，并對DEGs進行功能GO注釋（圖6），根據GO注釋結果，將差異表達基因歸屬于細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）三大生物學通路，且各自的差異表達基因通路分別有142、299和1 092條。以校正后的-Value（FDR)進行篩選（FDR≤0.001）發現，細胞組分、分子功能和生物過程三類注釋得到的差異表達基因通路分別有15、5和99條。根據各通路差異基因的富集程度及其層級關系，從中選出了3個具有代表性的細胞組分注釋和15個具有代表性的生物過程的注釋。由圖中可以看出，差異基因主要富集在生物及非生物脅迫的響應（response to water deprivation、defense response to bacterium）、激素響應（response to jasmonic acid stimulus、salicylic acid biosynthetic process、response to abscisic acid stimulus、salicylic acid mediated signaling pathway）、細胞程序性死亡（regulation of programmed cell death）以及轉錄因子活性（transcription factor activity）這四類通路上。

圖4 穗頂端敗育突變基因sipaa1的定位

圖6 突變體sipaa1與野生型Yugu1差異基因GO功能富集分析

2.5 差異表達基因的KEGG分類與富集分析

利用KOBAS軟件對差異表達基因的KEGG代謝途徑進行分析，選取其中富集程度最高的前20條pathway（圖7）。從圖中可以看出，差異表達基因（differential expresed genes，DEGs）大多存在于植物激素信號轉導、植物-病原互作、苯丙素的生物合成、淀粉和蔗糖代謝四大通路中，分別有56、49、48和43個；其次主要集中于糖酵解和糖異生作用、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、類胡蘿卜素的生物合成、苯丙氨酸代謝等，在次生物質代謝通路，如類黃酮生物合成、泛醌和其他萜類醌生物合成、角質，木栓質和蠟質生物合成等中的差異表達基因也有富集，而次生代謝產物對植物脅迫響應和抵抗病原侵襲有重要作用。由此推斷，很可能是突變體中生物或非生物脅迫引發細胞程序化死亡，最終導致了穗頂端敗育的表型。

2.6 候選基因在谷子中的表達與分析

根據Phytozome的對比結果，在定位區間In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內確定了6個穗部高度表達的候選基因，對6個候選基因的基因位置、基因長度、基因功能以及其在擬南芥和水稻中的同源基因進行了注釋（表2）。同時，對6個候選基因在谷子不同組織部位（包括萌芽期的幼苗、成苗期的葉、莖、根、穗）中的表達量進行了統計（圖8），結果差異顯著，而、與則表現為極顯著。

該圖表示差異基因富集程度最高的前20條pathway，橫軸表示富集的程度（用P-Value表示，該值越小表示富集程度越高），縱軸表示富集的KEGG Pathway Term。圓點大小表示該通路包含的差異基因數目

表2 候選基因功能分析

圖8 6個候選基因在植物不同組織部位的表達量

圖9 候選基因在Yugu1和sipaa1中的表達量

結合基因功能注釋、候選基因在谷子不同組織部位表達量以及候選基因在Yugu1和之間的表達差異結果進行綜合分析發現，在穗部高表達時會生產較多過氧化物酶體，過氧化物酶體能夠將光合作用的副產物乙醇酸氧化為過氧化氫，大量過氧化氫在植物體內累積導致細胞程序性死亡，表現出谷穗敗育的性狀。而是一種鈣結合EF手型家族蛋白基因，該基因編碼形成的蛋白質多參與植物體內脅迫反應，例如鈣依賴蛋白激酶CDPKs即為典型的EF手型家族蛋白，有研究證實該蛋白參與多種光、干旱等環境脅迫。這與RNAseq功能富集結果相符合。因此，預測候選基因和可能與突變體穗頂端敗育的形成有關。

3 討論

3.1 穗頂端敗育突變體sipaa1的表型比較分析

谷子的穗是一個由三級分枝及其上著生的小穗構成的頂生圓錐花序；每個小穗由兩朵小花組成，第一朵小花敗育，第二朵小花正常發育結實[27]。而突變體的穗頂端一級枝梗（分枝、谷碼）數顯著減少，第二小花不發育或發育不完全，導致谷碼數大幅減少，單穗粒重顯著降低。與谷子相比，玉米敗育的研究更為透徹。玉米敗育包括花敗育和粒敗育兩類。花敗育包括敗育花和未受精花，籽粒敗育包括未灌漿型敗育粒和已灌漿型敗育粒[28]。按照該分類標準，突變體在幼穗分化早期就已出現了頂端穗敗育的表型，生長錐發育異常導致穗頂端一級枝梗數大幅減少，小穗原基難以形成正常的小穗，因此，的敗育可歸為花不發育或者發育不全導致的穗頂端敗育。一般來說，幼穗分化、以及籽粒形成始于穗的中下部，以后由此處向上或向下同時進行，最后在頂部結束。頂部的小花或受精胚常因外界環境條件不適或自身遺傳因素的影響造成養分供應不足從而敗育，在谷穗頂端形成禿尖。

3.2 RNAseq分析表明突變體sipaa1中致變基因與脅迫響應及細胞死亡有關

據報道，穗頂端敗育是遺傳因素和植物生理作用二者互作的結果。因此，突變體穗頂端敗育既是其自身遺傳作用的結果，也是外界環境作用的結果[8]。徐云姬等[13]發現玉米中脫落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）等與籽粒發育呈正相關，赤霉素（GA3）為負相關。張秀梅等[29]發現BR（表油菜素內酯）與玉米敗育呈顯著負相關。本研究中，GO功能富集中差異表達基因主要在JA和ABA等激素應答通路中富集。同時，GO和KEGG分析表明差異表達基因富集于干旱脅迫或植物激素信號轉導，這與前人的研究結果基本一致。也有研究指出，植物在干旱條件下代謝異常，導致植物中可利用的蔗糖含量減少，這種外部傷害會激活衰老基因導致細胞程序化死亡，進而導致籽粒敗育[30]。由此可以推斷，該突變體穗頂端敗育與脅迫響應及激素信號轉導相關。高學曾等[31]發現與正常籽粒相比，敗育玉米籽粒中的過氧化氫酶及其同工酶表現出更高的活性。高素偉[32]通過DAB檢測發現過氧化氫的累積可能導致穗發育受阻，顯示小穗敗育可能是細胞程序性死亡的一種表現，本研究RNAseq的數據分析結果也符合這一猜想。因此，對過氧化氫與籽粒敗育關系的研究有待進一步深入。

3.3 候選基因初步探索

在Indel1-9.23與Indel1-9.322之間約100 kb范圍的定位區間內找到12個候選基因，通過分析候選基因在谷子不同組織部位的表達量差異，發現其中6個候選基因在突變體穗部的表達量明顯高于根、莖、葉等其他組織器官，分別為、、、、、。在數據庫中對候選基因進行查找發現，編碼過氧化物酶體的膜周邊或整合蛋白（peroxin-16，PEX16），該基因在擬南芥中的同源基因為且已被克隆，其缺失突變體種胚中沒有正常的過氧化物酶體，導致種子油脂和蛋白質含量將低，種子皺縮等現象，因此又被稱為（shrunken seed protein）[33-34]。為細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin dependent kinase 2，CDK2），在水稻中的同源基因是，推測其可能編碼細胞周期蛋白依賴性激酶A2（cyclin-dependent kinase A-2，CDKA2），屬于細胞周期蛋白依賴性激酶，該類基因控制細胞周期各個環節的起始，從而調控胚和胚乳的發育。是精氨酸/絲氨酸富集剪接因子4/5/6（splicing factor, arginine/serine-rich 4/5/6，SFRS4_5_6），參與RNA前體剪接過程；在擬南芥中的同源基因是，具有4個轉錄本、、和，該基因編碼RRM型結構域的RNA結合家族蛋白（RRM/RBD/RNP RNA-binding family proteins，RRM RBPs），在植物開花時間轉換、花發育、ABA信號通路、逆境響應、生物節律與染色質修飾等生長發育過程中起重要作用[35]。編碼EF手型鈣結構域結合蛋白（EF- HAND CALCIUM-BINDING DOMAIN CONTAINING PROTEIN），該基因在水稻中的同源基因是，屬于EF手型家族蛋白，該類基因參與植物體內鈣離子信號轉導，調控植物的花發育（成花誘導、花芽分化和開花調控）、有性生殖（花粉萌發和花粉管生長）、逆境生理等[36]。該基因的功能與突變體頂端敗育的性狀可能有一定的相關性。在擬南芥中的同源基因是，該基因編碼分子伴侶J-蛋白，該類蛋白參與植物重力信號過程和對外界多種刺激的響應[37]。編碼轉錄起始因子3J（translation initiation factor 3 subunit J，EIF3J），屬于轉錄起始因子家族，調節植物轉錄起始。綜合圖位克隆、RNAseq以及候選區間基因基因功能分析結果，和相關研究有待進一步深入。

4 結論

與Yugu1相比，突變體穗頂端較早的出現了敗育的表型，一、二級枝梗數驟減，谷碼數、千粒重等穗部性狀有顯著差異。谷子穗頂端敗育由隱性單基因控制，并將控制穗敗育表型的候選基因定位在谷子第1染色體標記In1-9.23與In1-9.322之間約100 kb范圍內，在該定位區間內的候選基因和參與了激素、干旱脅迫以及過氧化氫毒害等生理生化反應，而外界脅迫和過氧化氫累積與細胞程序性死亡密切相關。因此，谷子頂端小穗敗育可能是細胞程序性死亡的一種典型表現。

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（責任編輯 李莉）

附表1 試驗所用引物

Table S1 All primers involved in the article

引物名稱Primer name上游引物Forward primer (5′-3′)下游引物Reverse primer (5′-3′) In1-4.73GAGCAAGCCTCACGCCTCGGCATCAGTG In1-6.02TGGCATTTCTACACCTGGACCTCTATTCGTGCTGATT In1-7.35TAGGTAACAACGGGAAGTAGAAAGAGCAGGACCAT In1-8.77GCAGCCATCAGGCAAATCAGCCAGACAAGGAAGTAAAA In1-9.11GCGTGACGATAAATGAAACATAACACCTGCCATT In1-9.123GGGCTGTTGGTTTCTTGTCCTATTCCCACCGTTT In1-9.23TCCACGGTTGAAAGAGGCTGCACGAAGATGACAATAAA In1-9.322AGAACATACACCGAGGCTGGGAGGAGGTTGAAGAA In1-9.333CTAAAGCCTACTCCCTCTCTCCATATCATGCCTC In1-9.36ATTACGCAATCGTTCGGCCATAGGGAGCTGAGGG In1-9.42GGTTTATTTGTGCTGCCTGAAGAAGTGGCGATGGTGGG In1-9.80CGAATAGAATGCCCTCACAACGCAAACACGATAAGAC In1-10.143CAGAGTTTGGTTTGGGTGGATTGTCGTCGTCTTCG In1-16.2GCTAAACGGCAAGATACCCGTCACATCG In1-20.60CTTCACGGACACCTCATGGTAGAGTAGCAGGTAGGCAAT In1-24.0TATGGCATTTATTAGGAGTCTGTCTGAACATTGCGTAT

Morphological Characterization and Gene Mapping of a Panicle Apical Abortion Mutant () in Foxtail Millet

XUE Hongli1,2, YANG Junjun2, TANG Sha2, ZHI Hui2, WANG Rui2, JIA Guanqing2, QIAO Zhijun3, DIAO Xianmin2

(1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】Panicle development determines crop yield, and panicle apical abortion is one of the major limitation that affects the grain yield of foxtail millet. Our study explored the genes and biological pathways related to panicle apical abortion in foxtail millet, which provided a theoretical basis for the genetic mechanism of foxtail millet panicle development.【Method】A foxtail millet panicle apical abortion mutant, induced from Yugu1 by EMS treatment, was genetically identified. Agronomic traits of the mutant were investigated. The F2segregating population of× SSR41 was used for gene mapping. Based on differential expressed levels of candidate genes in five different tissues of foxtail millet, some genes highly expressed in the panicle was identified. Transcriptome sequencing of Yugu1 andyoung panicle at booting stage was conducted to find differential expressed genes and to analyze the biological pathways.【Result】The mutant exhibited thinner panicle, shorter leaf, less spikelets per panicle, lower spikelet numbers, as well as lower 1000-grain weight, compared with wildtype Yugu1. The agronomic traits of mutants showed that mutant leaf length, leaf width, panicle length, panicle diameter, panicle weight per plant, spikelet number per panicle, grain weight per spikelet and 1000-grain weight were decreased 10.66%, 5.08%, 11.36%, 16.12%, 30.02%, 32.58%, 30.55%, 18.18%, respectively. Genetic analysis showed that segregating ratio of wild type to mutant plants were 3:1 in×SSR41 F2generation, suggesting that the panicle apical abortion trait ofwas controlled by a single recessive nuclear gene. By map-based cloning, the candidate gene was mapped into a region between Indel markers In1-9.23 and In1-9.333 in chromosome 1, which contains a 100 kb interval. Combined with transcriptome sequencing, some candidate genes were found. Six candidate genes highly expressed in the panicle were further identified. Moreover, transcriptome sequencing showed that there were 2 768 up-regulated genes and 507 down-regulated genes between mutant and wild type. The differential expressed genes were mainly enriched in hormone signal transduction, external stress responses, plant-pathogen interaction.【Conclusion】Casual gene was limited into a 100 kb region between Indel markers 1-9.23 and 1-9.333 on chromosome 1 of foxtail millet. Combined transcriptome sequencing and gene function analysis, we identified two candidate genes that are highly expressed in panicle, and reported to participate in plant floral development and stress responses. Panicle apical abortion may be regulated by hormone, stress responses, and programmed cell death pathway.

; panicle apical abortion; phenotypic analysis; gene mapping; RNAseq

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.002

2018-02-08；

2018-03-06

國家自然科學基金（31501324）、中國農業科學院科技創新工程（Y2016XT05）、國家現代農業產業技術體系（CARS07-13.5-A02）、中國農業科學院創新工程雜糧團隊、中國農業科學院農科英才特資計劃

薛紅麗，E-mail：1729284709@qq.com。

喬治軍，E-mail：nkypzs@126.com。通信作者刁現民，E-mail：diaoxianmin@caas.cn