氯霉素與4-乙烯基吡啶分子印跡體系的理論優化與制備

高 芊，劉俊渤，唐珊珊，孫 琳，王光宇，靳瑞發

(1.吉林農業大學資源與環境學院，吉林，長春，130118; 2.赤峰學院化學化工學院，內蒙古，赤峰，024000)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種抑菌效果良好的廣譜抗生素類藥物，由于會引起人類的再生不良性貧血等疾病，我國農業部于2002年禁止使用該藥[1]，規定在所有食品動物的可食組織中不可檢出CAP。但由于CAP抗菌性好且價格低廉，養殖業上仍存在違法使用CAP。為有效監控CAP的違禁使用，合成一種能夠準確地富集和分離殘留于動物源性食品中CAP的新型萃取功能材料是非常必要的。

分子印跡技術也稱分子模板技術，是制備空間結構和結合位點與印跡分子相匹配的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)的一門分離技術。目前該技術廣泛應用于化學傳感器、模擬酶催化及藥物控釋等[2-4]領域。為提高MIPs在復雜基質動物源性食品中對待測物的特異吸附性，近年來分子模擬已廣泛應用于MIPs的設計[5-8]，為MIPs的制備提供了理論指導。

目前，國內外有關CAP分子印跡聚合物(CAP-MIPs)的研究主要以甲基丙烯酸(MAA)及丙烯酰胺(AM)為功能單體[9-10]，而以4-乙烯基吡啶(4-Vpy)為功能單體制備CAP-MIPs的相關研究極少，且未見在分子水平上構建空間模型用以研究CAP與4-Vpy的相互作用及CAP印跡體系中交聯劑優化的研究報道。因此，本研究以CAP為印跡分子，4-Vpy為功能單體，分別以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)為交聯劑，采用量子化學密度泛函理論(DFT)的ωB97XD方法，從理論上探討CAP與4-Vpy復合物的構型、印跡作用機理等，優化CAP與4-Vpy摩爾反應比例及交聯劑，同時以計算結果為指導，采用沉淀聚合法合成CAP-MIPs，并對CAP-MIPs的吸附性等性能進行了研究與表征。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器 CAP(標準品，上海阿拉丁試劑有限公司)；4-Vpy(化學純，阿法埃莎化學有限公司)；EGDMA、PETA、TRIM(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(ABIN)、乙腈(分析純，天津市光復科技發展有限公司)，甲醇、乙酸(分析純，北京化工)。

DZF-6062真空干燥箱(上海恒科儀器有限公司)；TU-1950雙光速紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山超生儀器有限公司)，SHZ-B水浴恒溫振蕩器(上海博迅實業有限公司)，TDL-60B臺式離心機(上海安亭科技儀器廠)。

1.2 理論計算部分 借助Gaussian 09軟件[11]構建CAP分子模型，分別使用B3LYP，LC-WPBE，PBE1PBE和ωB97XD四種DFT方法優化CAP印跡分子，收斂采用默認值。選取最接近實驗值的理論方法作為本研究的計算方法。采用自洽反應場中的Tomasi極化連續介質模型模擬CAP與4-Vpy、CAP與交聯劑、4-Vpy與交聯劑間的相互作用。計算結合能時，基組迭加誤差(Basis set superposition error，BSSE)采用Counterpoise(CP)方法消除[12]，印跡分子CAP與交聯劑摩爾比例為1∶1時，結合能(ΔE)計算公式如下：

ΔE=EC-ET-ECL

(1)

式中，EC為CP方法校正后印跡分子CAP與交聯劑形成復合物的總能量；ET為印跡分子CAP的能量；ECL為交聯劑的能量。

功能單體4-Vpy與交聯劑摩爾比例為1∶1時，結合能計算公式如下：

ΔE=EC-EF-ECL

(2)

式中，EC為CP方法校正后功能單體4-Vpy與交聯劑形成復合物的總能量；EF為功能單體4-Vpy的能量；ECL為交聯劑的能量。

1.3 氯霉素分子印跡聚合物與非印跡聚合物的制備 稱0.1 mmol CAP(0.0323g)溶于60 mL乙腈中，按一定摩爾比加入4-Vpy，超聲溶解后靜置24 h；加入交聯劑與引發劑，超聲30 min，通入氮氣5 min，除去體系中的氧氣；密封后，放入SHA-C恒溫水浴鍋中于60 ℃熱聚合24 h，將聚合物放于真空干燥箱中干燥24 h得到白色的聚合物沉淀；用冰乙酸/甲醇(1∶9，V/V)溶液于索氏提取器中洗脫印跡分子CAP，在用甲醇溶液洗脫至上清液中檢不出CAP為止；蒸干至恒重，得到CAP-MIPs微球。NIPs的制備不加CAP外，其余步驟同上。

1.4 聚合物的吸附性實驗 準確稱取20.0 mg的CAP-MIPs(NIPs)于50 mL錐形瓶中，加入100mg/L CAP甲醇溶液10 mL，超聲后放入振蕩器中室溫24 h，取上清液離心后用0.22微米的濾頭過濾，稀釋至一定濃度，用紫外分光光度計測量溶液吸光度，根據吸附前后濃度變化計算CAP-MIPs的吸附量Q(mg/g)：

Q=(C0-C)V/W

(3)

式中，其中Q為聚合物對CAP的吸附量(mg/g)，C0和C分別為CAP吸附前后的濃度(mg/L)，V為CAP甲醇溶液體積(ml)，W為CAP-MIPs(或NIPs)的質量(mg)。

1.5 掃描電鏡(SEM) 取少量的CAP-MIPs或NIPs懸浮液，用甲醇稀釋后超聲，使CAP-MIPs或NIPs微球分散均勻，取少量混合液均勻涂抹到硅片上自然晾干，噴金，采用JSM-5600掃描電鏡觀測CAP-MIPs與NIPs的粒徑大小及形貌。

2 結果與討論

2.1 計算方法 表1列出了B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD四種DFT方法對CAP分子(圖1)幾何結構的優化數據。由表1可知，四種方法計算所得的理論結構數據與實驗晶體數據相差不大，且均在誤差允許范圍內，說明DFT在幾何結構優化計算方面具有優勢。由表1還可知，與其他三種方法相比，ωB97XD[13]方法計算得到的CAP結構參數更接近其實驗值[14]。如C20-O7其鍵長實驗值為0.1442 nm，B3LYP、LC-WPBE、PBEIPBE和ωB97XD方法理論鍵長為0.1431、0.1418、0.1419、0.1434 nm，與實驗值的偏差為0.0011、0.0024、0.0023、0.0008 nm。C19-C18-O6其鍵角實驗值為119.94°，四種方法與實驗值偏差分別為1.60°、0.88°、1.39°、0.70°，顯然，相比于其他三種方法，ωB97XD方法優化計算得到的鍵長與鍵角參數與晶體數據值更接近。因此研究選取ωB97XD/6-31G(d,p)方法優化CAP、4-Vpy及其復合物幾何構型。

圖1 氯霉素的分子結構式Fig 1 Molecular structure of CAP

2.2 印跡分子與功能單體反應活性位點的確定 采用ωB97XD/6-31G(d,p)方法模擬計算印跡分子CAP與功能單體4-Vpy的幾何構型并計算原子的自然鍵軌道電荷(Natural bond orbital，NBO)，預測其印跡作用活性位點，結果見圖2。由圖2可知：從NBO電荷布局分析來看，CAP負電荷較多的原子主要是對硝基苯基、丙二醇、二氯乙酰胺基上的O原子與N原子，分別為O3、O4、O5、O6、O7、N9；正電荷較多的原子主要是丙二醇、二氯乙酰胺基上的H原子，如H21、H22、H23、H29。考慮與CAP印跡分子活性作用位點相互作用的主要是4-Vpy上的吡啶基，功能單體4-Vpy主要活性作用位點為H6、H9、N10。

表1 采用B3LYP，LC-WPBE，PBEIPBE 和 ωB97XD方法計算CAP的結構參數和實驗值Tab 1 Bond angles of CAP calculated at the B3LYP, LC-WPBE, PBEIPBE and ωB97XD levels and available experimental data

圖2 CAP(A)與4-Vpy(B)的NBO電荷分布Fig 2 NBO chanrges of CAP (A) and 4-Vpy(B)

2.3 CAP-MIPs 復合物印跡反應摩爾比例的優化 印跡分子CAP與功能單體4-Vpy反應比例合適時，相互作用較強，這種較強的相互作用可使制備的CAP-MIPs具有更好的穩定性與特異識別性。以NBO電荷布局為依據，借助Gaussian 09軟件構建分子模型模擬印跡分子CAP與功能單體4-Vpy在不同印跡摩爾反應比例下的復合物穩定構型及其氫鍵鍵合數據見圖3。計算模擬以相互作用位點越多，復合物越穩定的原則，選取最穩定的復合物構型作為研究對象。

從圖3可以看出，隨著CAP與4-Vpy摩爾反應比例增加，分子間作用位點氫鍵數目也在增加，即反應比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時，CAP與4-Vpy復合物氫鍵數目分別為2、5、7、9。這說明隨著印跡分子與功能單體的摩爾反應比例增大，穩定復合物中氫鍵數目增多，相互作用增強，形成的復合物也更穩定。當反應比例增加至1∶5時，功能單體間的相互作用，阻礙了印跡分子與功能單體間氫鍵的相互作用，最終導致反應比例為1∶5時的復合物氫鍵作用點低于1∶4，穩定性亦隨之降低。因此，反應比例為1∶4時的印跡分子與功能單體形成的復合物，見圖3(D)。穩定性最好，所有鍵的鍵長均在氫鍵范疇之內[15-16]。

圖3 CAP與4-Vpy在不同摩爾反應比例下的復合物構型Fig 3 The complex configurations of CAP and 4-Vpy at different molar ratios

表2 CAP與4-Vpy在不同摩爾反應比例下結合能(ΔE)(kJ/mol)Tab 2 the Binding energies (ΔE) of CAP and 4-Vpy in different imprinted molar ratio (kJ/mol)

2.4 交聯劑的優化 MIPs制備過程中，交聯劑的作用是使印跡分子與功能單體聚合形成高度交聯、剛性的聚合物。交聯劑控制著聚合物的形態以及聚合物的物理化學性質，同時影響聚合物的識別性能。為了使制備的MIPs既具有一定的剛性以維持孔穴，又有一定的柔韌性以便與印跡分子再結合，所選的交聯劑與印跡分子的結合能應高于其與功能單體的結合能。EGDMA、PETA、TRIM三種交聯劑與印跡分子CAP、功能單體4-Vpy的結合能見圖4。由圖4可知，所有的交聯劑與印跡分子CAP的結合能不僅都高于其與功能單體4-Vpy的結合能，且高于印跡分子與功能單體的結合能-58.26 kJ/mol(表2)，說明三種交聯劑均適合作為CAP-MIPs的交聯劑。但是由于PETA與印跡分子CAP結合能最高，與功能單體4-Vpy的結合能最低。因此，PETA更適合作為CAP-MIPs的交聯劑。

2.5 聚合物的吸附性 在333 K乙腈溶劑中，分別以EGDMA、PETA及TRIM為交聯劑制備CAP與4-Vpy最佳印跡摩爾比例(1∶4)MIPs與NIPs，并測定其吸附性。由圖5可知，以PETA為交聯劑制備的CAP-MIPs對CAP的平衡吸附量最高，其次為TRIM、EGDMA。這說明PETA比其它交聯劑更適合制備CAP-MIPs，也說明了適合的交聯劑有助提高CAP-MIPs的印跡效果。同時，該實驗結果與上述理論計算結果一致，再一次證明理論計算的準確性。

在333 K乙腈溶劑中，以PETA為交聯劑制備CAP與4-Vpy在1∶1～1∶5摩爾反應比例下的MIPs和NIPs，并測其吸附性。由圖6可知，隨著印跡摩爾比例的遞增，聚合物的平衡吸附量在逐漸增加。當反應比例為1∶5時，其吸附性略有降低。這說明CAP與4-Vpy的最佳反應比例為1∶4，與上述計算結果一致。此外，從圖中還可以看出所有對應反應比例下MIPs的平衡吸附量明顯高于NIPs，說明印跡微球存在與CAP分子空間結構相互匹配的孔穴，對底物的選擇識別起了關鍵作用。

為探討以4-Vpy為功能單體制備的CAP-MIPs和NIPs微球形貌、粒徑大小與分布范圍，采用掃描電子顯微鏡對其進行了表征(圖7)。由圖7可知在333 K乙腈溶劑中制備的CAP-MIPs和NIPs形態比較均一，都近似球狀，且分散性良好。借助Nano Measurer 1.2軟件對聚合物微球進行粒徑分布分析，結果表明CAP-MIPs與NIPs粒徑分別在180～370 nm(平均粒徑285 nm)與130～350 nm(平均粒徑224 nm)范圍內，CAP-MIPs的粒徑略大，這可能是由于CAP-MIPs中模板分子的存在占有一定的空間體積，從而表現為粒徑更大。

在最佳實驗條件下，采用Scatchard方程進一步研究了以4-Vpy為功能單體，PETA為交聯劑制備的CAP-MIPs的吸附性能。Scatchard公式如下：

圖4 CAP和交聯劑(CL)與4-Vpy和交聯劑(CL)的結合能(ΔE)Fig 4 Binding energies (ΔEB) of CAP and cross-linking agents(CL) as well as 4-Vpy and cross-linking agents(CL)

圖5 不同交聯劑制備的CAP-MIPs與NIPs的吸附量Fig 5 Equilibrium adsorption amount of MIPs and NIPs synthesized with different cross-linking agents

圖6 不同摩爾反應比例下的CAP-MIPs與NIPs的吸附量Fig 6 Equilibrium adsorption amount of CAP-MIPs and NIPs in different molar rations

圖7 CAP-MIPs與NIPs的掃描電鏡與粒徑分布圖Fig 7 SEM photographs and particle size distributions of CAP-MIPs and NIPs

式中，Q是平衡時吸附到聚合物上的CAP的量(mg/g)；[CAP]是平衡時溶液中剩余的CAP的濃度(mg/L)；Kd是解離常數(mg/L)；Qmax是聚合物的最大表觀吸附量(mg/g)。

以Q/C對Q作圖，得到一條線性相關的Scatchard直線，見圖8。由圖8知：

Q/C=0.0621-8.3955×10-4Q(5)

由直線斜率與截距求得：CAP-MIPs的解離常數(Kd)和最大表觀吸附量(Qmax)分別為1191 mg/L和73.97 mg/g。

圖8 CAP-MIPs的Scatchard曲線Fig 8 Scatchard plot of CAP-MIPs

3 結 論

采用DFT的ωB97XD/6-31G(d,p)方法模擬研究了CAP印跡分子與4-Vpy功能單體復合物的構型及印跡作用機理，優化了摩爾反應比例和交聯劑。理論與實驗結果均表明：CAP與4-Vpy的最佳摩爾反應比例為1∶4，以PETA作為交聯劑制備的CAP-MIPs具有相對較大的吸附量。Scatchard分析方程表明：在最佳印跡條件下制備的CAP-MIPs對CAP表現出較高的吸附能力，最大表觀吸附量為73.97 mg/g。本研究為CAP-MIPs應用于復雜基質食品中CAP殘留的分離和檢測提供了一定的理論與實驗數據。

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