海帶多糖LJP61A對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控機(jī)制研究

陳浩然

摘要 [目的]探討海帶多糖LJP61A對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控作用。[方法]采用高脂飲食誘導(dǎo)LDLr-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，用海帶多糖LJP61A進(jìn)行灌胃，觀察其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控機(jī)制。[結(jié)果]LJP61A可以緩解動(dòng)脈粥樣硬化引起的血管斑塊形成，并下調(diào)血管炎癥。隨著海帶多糖添加量的增加，抗動(dòng)脈粥樣硬化作用增強(qiáng)。[結(jié)論]海帶多糖LJP61A可以通過減輕血管炎癥來發(fā)揮干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)制。

關(guān)鍵詞 海帶多糖；動(dòng)脈粥樣硬化；調(diào)控機(jī)制

中圖分類號(hào) R543.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0158-04

Abstract [Objective] To discuss the regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis. [Method] LDLr-/- mouse atherosclerosis model was induced by highfat diet. Mice was fed with Laminarin LJP61A by intragastric administration.The regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis was observed. [Result] LJP61A could relieve atherosclerotic plaque formation and reduce vascular inflammation. With the increase of laminarin dose， antiatherosclerosis strengthened.[Conclusion]LJP61A could play a role in the regulation mechanism of atherosclerosis by reducing blood vessel inflammation.

Key words Laminarin；Atherosclerosis；Regulation mechanism

動(dòng)脈粥樣硬化主要是由于機(jī)體脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙而引起的局部或全身性血管病變[1]。動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要機(jī)制是由于大量炎癥的誘導(dǎo)，此過程中多種免疫細(xì)胞參與其中[2]。

海帶屬于褐藻類植物，呈扁平帶狀，最長可達(dá)到20 m，因其多產(chǎn)及獨(dú)特的口感已被廣泛用作烹飪食材。研究表明，海帶多糖LJP61A能夠通過減緩主動(dòng)脈血管鈣化來干預(yù)腎衰竭的進(jìn)程，并且海帶多糖還具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等作用[3-11]。筆者探討了海帶多糖LJP61A緩解動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。新鮮海帶頭購自安徽省合肥市包河區(qū)家樂福超市； LDLr-/-小鼠由合肥工業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2

主要試劑。ELISA試劑盒購自源葉生物公司；油紅O染色液購自索萊寶公司；蘇木素購自索萊寶公司；辛伐他汀購自杭州默沙東制藥有限公司。

1.1.3

主要儀器。磁力攪拌器由德國IKA公司生產(chǎn)；紫外分光度計(jì)購自上海美浦達(dá)公司。

1.2 方法

1.2.1

海帶多糖的提取。海帶多糖（LJP61A）經(jīng)過清洗曬干后磨粉，然后通過水提醇沉得到醇提物，經(jīng)脫蛋白透析后得到粗多糖，再經(jīng)DEAE和S500離子交換樹脂過濾得到單一組分LJP61A[12-13]。

1.2.2 飼喂試驗(yàn)。將LDLr-/-雄性小鼠（7周齡）在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組別，每組16只，分別為正常對(duì)照組（普通低脂日糧，LFD）、模型組（高脂日糧，HFD）、低劑量海帶多糖組[高脂日糧+LJP61A 50 mg/（kg·d）]、高劑量海帶多糖組[高脂日糧+LJP61A 200 mg/（kg·d）]及陽性對(duì)照組[0.014 g/（kg·d）辛伐他汀，SIM]。正常對(duì)照組小鼠飼喂普通低脂日糧，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。高脂日糧配方參考文獻(xiàn)[14]。連續(xù)喂養(yǎng)14周，每周測量各組小鼠的體重，14周后禁食過夜，用CO2處死。取一半腎臟置于PBS緩沖液中，于-4 ℃下保存；將另一半腎臟浸泡于4%多聚甲醛中。

1.2.3

血管的油紅O染色。將主動(dòng)脈根部的血管標(biāo)本從4%的多聚甲醛固定液中取出，漂洗剝膜。取60 mL儲(chǔ)備液，加入蒸餾水至100 mL，染色。最后用蒸餾水浸泡標(biāo)本，將處理好的血管腔展開，并固定形態(tài)，使用Image-Pro Plus Version 6.0軟件分析計(jì)算斑塊面積。

1.2.4

主動(dòng)脈弓HE染色。將主動(dòng)脈弓的石蠟切片分別置于100%的二甲苯和二甲苯與乙醇（按1∶1混合）溶液中15 min脫蠟；脫蠟后的切片分別用100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液脫水1 min，再用95%乙醇溶液、100%乙醇脫水；松節(jié)油浸入后，烘干封片。

1.2.5

巨噬細(xì)胞CD68的免疫組化。利用二步法免疫組織化學(xué)檢測系統(tǒng)，將石蠟包埋的切片置于60 ℃烘箱中烤片1 h，用二甲苯、酒精脫蠟后依次用自來水沖洗2 min，放入去離子水使用搖床振蕩清洗，重復(fù)2次，用滅菌生理鹽水（0.01 mol/L）持續(xù)沖洗5 min，重復(fù)3次。將切片放入室溫下的0.01 mol/L檸檬酸鹽修復(fù)液中置于微波爐80 ℃加熱5 min，然后40 ℃低火持續(xù)15 min，取出室溫下自然冷卻，在搖床上使用PBS緩沖液清洗1次。加入3%的H2O2 去離子水室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，使用PBS緩沖液清洗3次后加入血清稀釋的一抗CD68（37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育過夜），取出后加入即用型Polymer Helper和即用型Polyperoxidase-anti-mouse IgG 20 min，并用PBS緩沖液沖洗3次后加入DAB顯色液。

1.2.6

ELISA檢測動(dòng)脈粥樣硬化血管中炎性因子的水平。按照ELISA試劑盒操作步驟測定TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.7

熒光定量PCR檢測動(dòng)脈粥樣硬化血管中炎性因子mRNA的表達(dá)。精確稱量小鼠血管組織100 mg，用滅菌消毒的手術(shù)剪在冰上充分均勻剪碎后，放入1 mL勻漿器中，各加入TRlzol 1 mL于冰上充分研磨，將組織勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中室溫下靜置5 min，放入低溫高速離心機(jī)下（4 ℃，12 000 r/min）離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，加入氯仿200 μL，連續(xù)振蕩15 s，使其充分混勻，在室溫下靜置10 min。然后，放入低溫高速離心機(jī)下（4 ℃，12 000 r/min）離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中。加入異丙醇500 μL，輕輕搖晃管中液體，室溫下靜置10 min，管底出現(xiàn)乳白色膠狀沉淀，即為RNA。最后，使用低溫高速離心機(jī)（4 ℃，12 000 r/min）離心10 min，吸掉上清。各加入1 mL乙醇（75%）清洗沉淀物，輕輕搖晃漂洗，8 000 r/min離心5 min，保留沉淀并在室溫下將EP管倒置于濾紙上晾干，分別加入DEPC 20 μL水使RNA溶解，充分振蕩混勻。用移液槍吸取RNA溶液1 μL，使用Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter儀器測定RNA濃度及相對(duì)吸光度（A260/A280），以判定提取的RNA是否達(dá)標(biāo)。最后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。定量PCR引物見表1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果均以±SD表示，用方差分析進(jìn)行顯著性比較。*表示與正常對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；**表示與正常對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）；#表示與模型組差異顯著（P<0.05）；##表示與模型組差異極顯著（P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 主動(dòng)脈的油紅O染色

各組小鼠主動(dòng)脈的油紅O染色結(jié)果如圖1所示。從圖2可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型組動(dòng)脈粥樣硬化面積占總面積的比例極顯著增加（P<0.01）。高劑量海帶多糖組、低劑量海帶多糖組與陽性對(duì)照組動(dòng)脈粥樣硬化面積占總面積的比例均顯著低于模型組。隨著海帶多糖LJP61A添加量的增加，動(dòng)脈粥樣斑塊的面積越小。

2.2 主動(dòng)脈弓HE染色

從圖3可以看出，模型組小鼠血管內(nèi)壁有明顯的脂塊堆積，而低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組血管內(nèi)壁脂塊堆積程度明顯降低。

2.3 巨噬細(xì)胞CD68的免疫組化染色

從圖4可以看出，正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈中巨噬細(xì)胞的CD68表達(dá)穩(wěn)定，而模型組巨噬細(xì)胞的CD68明顯增多，低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組CD68陽性表達(dá)顯著減少。

2.4 LJP61A對(duì)小鼠血管炎性因子含量的影響

從圖5可以看出，模型組小鼠血管內(nèi)的TNF-α、IL-1β和IL-6大量增加；低劑量海帶多糖組和高劑量海帶多糖組TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低，且隨著LJP61A添加量的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低。這表明海帶多糖LJP61A能夠顯著抑制炎性因子的增加。

2.5 LJP61A對(duì)血管中炎性因子mRNA表達(dá)的影響

由圖6可知，與模型組相比，海帶多糖LJP61A干預(yù)組能明顯下調(diào)TNF-α、IL-6的表達(dá)，且隨著LJP61A添加量的增加，下調(diào)作用越明顯。

3 討論

臨床研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展最終導(dǎo)致易損斑塊的發(fā)展，這可能增加心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。血管壁中活性氧的增加或減少是動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)的血管滋養(yǎng)層密度較高，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期事件，此外，編碼VEGF的腺病毒的外膜遞送引發(fā)新血管的生成和內(nèi)膜增生，而血管生成抑制劑減弱斑塊生長。在人體內(nèi)，伴有出血的斑塊內(nèi)血管的生成主要與薄壁動(dòng)脈粥樣硬化，巨噬細(xì)胞浸潤與大的壞死核心（即脆弱斑塊）有關(guān)。斑塊新生血管通常是滲漏的，因此可能會(huì)釋放斑塊內(nèi)紅血球（出血）。此外，動(dòng)脈粥樣硬化病變誘發(fā)的壁內(nèi)出血與紅細(xì)胞碎片增多、鐵沉積、泡沫細(xì)胞和膽固醇晶體形成有關(guān)。

血管生成過程可以由缺氧誘導(dǎo)的表達(dá)和血管生成因子釋放（例如VEGF）直至氧量正常恢復(fù)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，由于內(nèi)膜增厚和炎癥，動(dòng)脈腔內(nèi)的局部O2擴(kuò)散可能不足。缺氧和炎癥狀態(tài)促進(jìn)血管生成和炎癥因子的釋放，這些因子刺激從血管滋養(yǎng)血管發(fā)芽血管生成。這種新血管可以提供營養(yǎng)，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤，血管壁增厚，脂質(zhì)沉積，炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展。因此，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊小鼠具有較高的炎性細(xì)胞浸潤。

平滑肌含量使纖維帽變薄和斑塊內(nèi)出血。另外，斑塊肩區(qū)域在內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和纖維帽膠原中有較高水平的鈣蛋白酶-2、半胱天冬酶-3和基質(zhì)金屬蛋白酶-2。海帶多糖LJP61A可能是抗炎相關(guān)和氧化應(yīng)激相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥的可行治療策略。動(dòng)脈粥樣硬化是以大量膽固醇和非分解性炎癥為特征的中大動(dòng)脈血管壁的多灶性改變。動(dòng)脈粥樣硬化病變中的新血管形成在斑塊生長和不穩(wěn)定性中起主要作用。血管生成過程由經(jīng)典血管生成因子和特異于動(dòng)脈粥樣硬化血管生成的其他因子介導(dǎo)。除了在斑塊進(jìn)展中的作用外，新血管形成可能參與斑塊不穩(wěn)定和血栓栓塞事件。在各種動(dòng)物模型中，抗血管生成劑對(duì)于減輕動(dòng)脈粥樣硬化是有效的。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的變化特征在于從病理內(nèi)膜增厚進(jìn)展到纖維粥樣瘤薄帽纖維粥樣瘤[15]，并最終到斑塊破裂和血栓形成。這些斑塊通常被描述為不穩(wěn)定或易損斑塊，其特征在于巨大的壞死核心和變薄的纖維帽，其被巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤并且缺乏或少量平滑肌細(xì)胞。目前動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理生理學(xué)已被廣泛研究[16-17]。然而，斑塊進(jìn)展的分子機(jī)制和斑塊破裂的觸發(fā)因素尚不確定。該研究結(jié)果表明，CD68表達(dá)增加了巨噬細(xì)胞的內(nèi)皮下堆積，這在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期間在巨噬細(xì)胞浸潤或增殖或自身抗體形成方面具有廣闊的病理意義[18-19]，而海帶多糖LJP61A能夠通過降低炎性因子的表達(dá)和聚集來緩解血管動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

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