大豆異黃酮檢測(cè)方法的優(yōu)化

徐佳璐

摘要：本文研究使用高效液相色譜儀對(duì)大豆中常見(jiàn)的四種異黃酮進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的最佳色譜條件為：選取碳18色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，選取乙酸水溶液（0.1%）為流動(dòng)相A，選取乙酸甲醇溶液（0.1%）為流動(dòng)相B，以0.8 mL/min的流速依次進(jìn)行梯度洗脫。設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，在此條件下待測(cè)組分都能夠達(dá)到比較理想的分離，計(jì)算所得的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為大豆甙R2 =0. 9996、染料木甙R2一0. 9995、大豆苷元R2 =0. 9997、染料木素R2 =0. 9993，線性表現(xiàn)良好。

關(guān)鍵詞：大豆；異黃酮檢測(cè)；高效液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S5 65.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：2095-9737（2018）03-0011-01

1 流動(dòng)相選擇

國(guó)標(biāo)方法當(dāng)中選用的流動(dòng)相為乙腈，乙腈的毒性較大。根據(jù)乙腈的極性較強(qiáng)的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中也使用強(qiáng)極性的流動(dòng)相進(jìn)行代替。為了在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到洗脫效果，本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇作為乙腈的替代品，采用不同濃度的甲醇水溶液及甲醇乙酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，尋找合適的洗脫劑，使得各組分得到快速有效的分離。

2 流速選擇及梯度洗脫方案設(shè)計(jì)

流動(dòng)相的流速對(duì)組分的分離效果，分離時(shí)間以及峰形都有較大的影響。流動(dòng)速度加快洗脫速度，縮短洗脫時(shí)間，加快試驗(yàn)速度，會(huì)使峰形變窄，但同時(shí)會(huì)使得峰與峰之間的距離縮短，流動(dòng)相流動(dòng)速度太快會(huì)使得組分分離不完全，但是流動(dòng)相流速過(guò)快又會(huì)使得實(shí)驗(yàn)時(shí)間加長(zhǎng)，峰寬變大。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的流速進(jìn)行調(diào)整，在不同的階段采用不同的流速，以求用最短的洗脫時(shí)間，達(dá)到最佳的分離效果。

3 實(shí)驗(yàn)方法步驟

3.1 儀器和試劑

高效液相色譜；分析天平（0.OO01 g）；四種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（大豆甙、染料木甙、大豆苷元、染料木素）；甲醇（色譜純）；乙酸（色譜純）；一級(jí)實(shí)驗(yàn)用水。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

用分析天平（0.OO01 g）分別準(zhǔn)確稱(chēng)取四種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，并用甲醇水溶液（濃度為60%）配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度為1 mg/mL）。用單標(biāo)式移液管分別準(zhǔn)確吸取四種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中配置標(biāo)準(zhǔn)序列溶液，濃度分別為Oμg/mL、10.Oμ/g/mL、20.Oμg/mL、40.Oμg/mL、80.Oμg/mL、200.Oμg/mL。

3.3 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

流動(dòng)相濃度：選取乙酸水溶液為流動(dòng)相A，選取乙酸甲醇溶液為流動(dòng)相B，分別配置濃度均為0.1%、0.2%、0.3%的流動(dòng)相A、B；

流動(dòng)相流速：分別采取0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.O mL/min的流速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；

梯度洗脫方案：設(shè)定流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的比例：分別采取O min（50： 50），6 min（55： 45），12 min（75： 25），15 min（50：50）四個(gè)時(shí)間梯度；O min（50：50），6 min（550：45），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）五個(gè)時(shí)間梯度；O min（ 50： 50），4 min （55： 45），6 min（ 65： 35），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）六個(gè)時(shí)間梯度，分別采用三個(gè)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)條件：選用安捷倫碳18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；分別采用不同的流動(dòng)相，不同的流動(dòng)相速度以及采用不同的梯度洗脫方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行五次平行實(shí)驗(yàn)，選取最優(yōu)的效果進(jìn)行比較討論。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別以每組實(shí)驗(yàn)測(cè)得的四個(gè)組分的峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)序列溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，分別得到四種選取的大豆異黃酮檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并分別計(jì)算其線性相關(guān)系數(shù)R2。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

用單標(biāo)線移液管分別準(zhǔn)確吸取四種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 mL，6 mL、8 mL用甲醇水溶液（濃度為60%）定容至10 mL，用優(yōu)化后的條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算所得濃度，每個(gè)樣品做兩次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算本方法的回收率以評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。

4 數(shù)據(jù)及討論

通過(guò)計(jì)算幾組實(shí)驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)可知，以乙酸水溶液（0.1%）為流動(dòng)相A，以乙酸甲醇溶液（0.1%）為流動(dòng)相B，流速為0.8 mL/min，選擇五個(gè)時(shí)間梯度，在260 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)得到的線性相關(guān)系數(shù)最好，大豆甙R2=0. 9996、染料木甙R2=0. 9995、大豆苷元R2=0. 9997、染料木素R2-0. 9993。因此在此條件下四種待測(cè)組分均達(dá)到了理想的的基線分離，四種異黃酮的峰能夠完全分離，且全部具有理想的譜峰形態(tài)。回收率實(shí)驗(yàn)中四種組分的回收率分別為92%—103%、94% -105%、91% -102%、89% -107%，根據(jù)《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》有關(guān)規(guī)定，高效液相檢測(cè)方法的平均加樣回收率控制在80%—120%之間，均在誤差允許范圍內(nèi)。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)優(yōu)化后能夠在15 min內(nèi)完成，并且根據(jù)線性相關(guān)系數(shù)和回收率實(shí)驗(yàn)可以看出，本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)大豆異黃酮各個(gè)組分的方法能夠做到準(zhǔn)確、快速定量。