經后增殖方對超排卵大鼠卵巢顆粒細胞Fas 通路的影響

陳艷婷 郭新宇 袁秋虹 鄧偉民

1廣州軍區廣州總醫院內六科（廣州510010）；2廣州中醫藥大學（廣州510405）；3廣州軍區廣州總醫院輔助生殖中心（廣州510010）

子宮內膜容受性與胚胎質量是體外受精-胚胎移植（IVF?ET）成功與否的兩個重要條件。研究證實，IVF?ET過程中控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）可能從一定程度損害卵母細胞染色體的結構和功能，進而影響胚胎基因表達，降低胚胎質量及著床潛能，但其具體機制尚不明確。現代醫學對如何改善超排卵胚胎質量尚未獲得普遍公認的研究成果，傳統中醫學對此做了很多有意義的探索［1-2］，但大都局限于子宮內膜容受性的研究，且多為臨床現象的觀察。本課題組前期研究提示經后增殖方在相同子宮內膜容受性的基礎上提高了胚胎本身的著床能力［3］，結合該方的方藥分析，我們認為其可能是通過改善卵母細胞質量而提高胚胎本身的種植能力，并通過動物實驗證實了該方可改善COH狀態下卵母細胞質量，提高卵母細胞發育潛能，從而促進胚胎種植。Fas通路是經典細胞凋亡通路之一，在人體大多數器官廣泛存在，可介導多種組織細胞凋亡。本實驗在前期研究的基礎上，將中藥經后增殖方與IVF?ET技術結合進行系統的動物實驗研究，通過測定Fas通路上關鍵凋亡因子Fas、Fasl、Caspase?8、Caspase?3在卵巢組織中的表達，旨在進一步探討中藥改善卵母細胞質量的可能作用機制，為在COH過程中早期中藥干預，從而改善卵泡質量，提高妊娠率提供實驗依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用藥、試劑與儀器 醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士輝凌公司，批號：K18565B）；注射用血促性素（又名孕馬血清促性腺激素，杭州動物藥品廠，批號：110204564）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠藥業有限公司，批號：160201）；經后增殖方（顆粒劑，1包，相當于生藥：黨參15 g，白術12 g，茯苓12 g，甘草6 g，熟地黃12 g，白芍12 g，當歸6 g，川芎6 g，菟絲子15 g，鹿角霜20 g，杜仲15 g，山萸肉10 g，川椒3 g。廣東一方制藥廠，批號：Q1704009）。FAS一抗（Abcam公司），FASL一抗（Affinity Biosciences），Caspase8一抗（Abcam公司），Caspase3一抗（Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG（Jackson公司），BCA蛋白定量試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司），預染蛋白Marker（Fermantas公司），ECL發光液（杭州弗德生物科技有限公司），逆轉錄試劑盒（DBI公司），熒光定量PCR檢測試劑盒（Genecopoeia公司），熒光定量PCR儀（ABI公司），微量核酸定量儀（Merinton公司）。

1.1.2 實驗動物及分組 SPF級SD雌性大鼠30只，鼠齡6～8周，體質量180～220 g，由本院動物實驗中心提供，合格證號：44002100011623。適應性飼養1周后進入實驗階段，自由取水和攝食，以陰道脫落細胞涂片檢查動情周期（陰道涂片全為無核角化細胞，間或有少量上皮細胞）。使用Ex?cel軟件隨機分為3組：空白組、陽性組、中藥組，每組10只。中藥組和陽性組于陰道涂片為動情后期（動情周期第3天）時，每日9：00 am腹腔注射醋酸曲普瑞林20 μg/kg，連續9 d，第9天同時腹腔注射孕馬血清400 U/kg，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）1 000 U/kg?？瞻捉M每日給予等體積生理鹽水腹腔注射。中藥組每日給予臨床等效劑量的經后增殖方灌胃（1.5 mg/kg），陽性組與空白組以等體積生理鹽水灌胃。

1.1.3 標本取材 腹腔注射HCG 2 h后頸椎脫臼處死大鼠，快速取出雙側卵巢，經液氮速凍5 min后置于-80℃冰箱凍存。

1.2 實驗方法

1.2.1 qPCR檢測 qPCR檢測卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA的相對表達量按照試劑盒說明書進行PCR反應，制作標準曲線，根據標準曲線擴增效率的一致性，用2-ΔΔCt法分別計算 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 的相對表達量。引物序列及PCR產物大小見表1。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primer

1.2.2 Western?blot檢測 Western blot檢測卵巢組織中 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 蛋白的表達取適量卵巢組織提取總蛋白溶液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定各組蛋白濃度。采用Image J軟件處理系統分析目標帶的光密度值（OD）。分別以 Fas/β?actin，Fasl/β?actin，Caspase8/β?actin，Cas?pase3/β?actin的相對OD值表示結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計學分析，數據以均數±標準差表示。多組間比較用單因素方差分析，組間的多重比較采用LSD分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠卵巢組織中 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA相對表達量比較 3組大鼠卵巢組織中 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 相對表達量陽性組即控制性超排卵組較空白組和中藥組 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 的轉錄水平增高，其中，空白組與陽性組具有顯著差異（分別為P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.002）。中藥組Fas，Fasl，Caspase?8 mRNA轉錄水平與陽性組相比差異具有顯著性（分別為P=0.000，P=0.008，P=0.000），但Caspase3 mRNA表達水平與陽性組無統計學意義（P=0.078）。中藥組Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA相對表達量與空白組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 3 組大鼠卵巢組織中 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達量比較 3組大鼠卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 蛋白的表達陽性組經超促排卵干預后 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達較空白組和中藥組增高，其中空白組與陽性組相比差異具有顯著性（分別為P=0.004，P=0.003，P=0.001，P=0.008）。中藥組Caspase?3蛋白表達較陽性組下降，但差異無統計學意義（P=0.110），中藥組Fas，Fasl，Caspase?8表達與陽性組相比差異具有統計學意義（分別為P=0.046，P=0.048，P=0.042）。中藥組 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達高于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖 1 3組大鼠卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3mRNA相對表達量比較Fig.1 Expression of Fas，Fasl，Caspase?8 and Caspase?3 mRNA in ovarian tissues of rats

表2 3組大鼠卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達量比較Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

表2 3組大鼠卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達量比較Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

注：與陽性組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

n組別陽性組空白組中藥組10 10 10 Fas/β?actin 0.520±0.102#0.308±0.081**0.395±0.024*Fasl/β?actin 0.643±0.060#0.460±0.043**0.540±0.082*Caspase?8/β?actin 0.495±0.010#0.293±0.030**0.390±0.032*Caspase3/β?actin 0.758±0.146 0.415±0.099**0.580±0.170

圖2 3組大鼠卵巢組織中Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3蛋白表達量比較Fig.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase?8 and Caspase?3 proteins in ovarian tissues of rats

3 討論

《素問·上古天真論》云：“二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子也”。腎中精氣充盛，精血充盈，月經來潮，具備生育的基本條件。經后期的病理特點主要表現為血、陰、精的不足，血?？仗?。經后增殖方具有補益氣血，補腎滋陰之功效，全方以四君子湯加四物湯組成補益氣血的主藥；加鹿角霜、山萸肉以補腎滋陰；但陽生方能陰長，故宜選加甘溫補養之品，以陽中求陰，選用杜仲、菟絲子、川椒補腎助陽。全方使氣血旺盛，沖任得滋，胎孕易成。IVF?ET過程中控制性超排卵降低了卵母細胞發育潛能，影響胚胎種植率，導致臨床妊娠率低。本課題組前期研究已表明，中藥經后增殖方可提高IVF?ET患者的胚胎種植率和臨床妊娠率，并對經后增殖方與控制性超排卵大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的關系進行了初步探討［4-5］。因此，為了對經后增殖方的作用機制進行進一步研究，本研究選取了Fas細胞凋亡通路進行研究。

卵泡是卵巢的基本結構和功能單位，卵泡的成熟與閉鎖取決于卵泡內顆粒細胞的狀態：顆粒細胞增殖分化則卵泡成熟，顆粒細胞凋亡則卵泡閉鎖。顆粒細胞伴隨著卵母細胞發育、成熟、排卵至受精的全過程，對卵母細胞的發育至關重要［7］。細胞凋亡的發生和抑制與不同的基因有關，以Fas系統為代表的死亡受體信號轉導途徑是其中的重要凋亡途徑之一［8-9］。Fas系統屬于腫瘤壞死因子受體家族，Fas是一種細胞膜糖蛋白，FasL是其同源的Ⅱ型膜蛋白，是其體內唯一的天然配體。Fas存在于靶細胞上，FasL通過三聚體的形式與之相結合，導致Fas相關死亡結構域（FADD）被激活。相應的，FADD構成procaspase?8自我活化一個對接點，Caspase?8是caspase家族的啟動者，caspase家族一旦激活，Caspase?8可激活其他下游caspase蛋白酶。其中，Caspase?3是Fas介導細胞凋亡信號傳導通路中的“核心”蛋白酶，是細胞凋亡性死亡的最終執行者［10］。因此，Fas?Fasl?FADD?Caspase?8?Caspase?3 通路的激活最終導致細胞凋亡不可逆的發生。

本實驗運用了qPCR和Western Blot技術檢測Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3 mRNA 和蛋白在大鼠卵巢組織中的表達。結果顯示，陽性組即控制性超排卵組，在Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3基因及蛋白的表達上均呈現出較高表達，且顯著高于空白組，說明COH過程可導致卵巢顆粒細胞凋亡的發生，從而影響卵母細胞質量，這與PARKER和BARROS等的研究結果一致［11-12］，表明COH可能會損害卵母細胞的基因表達進而影響胚胎質量。李婷婷等［13］研究表明，中藥二至天癸顆粒可下調腎氣虛不孕患者卵泡液顆粒細胞Fas基因表達水平，推測二至天癸顆粒可能是通過下調Fas通路的表達來抑制顆粒細胞凋亡。蔣帥［14］研究證實中藥六味地黃免煎顆粒能明顯抑制腎陰虛型IVF?ET患者Fas介導的顆粒細胞凋亡信號通路，改善卵巢“封藏”功能，提高卵細胞質量，從而提高IVF?ET的臨床妊娠率。但以上研究局限于對臨床腎氣虛及腎陰虛不孕癥患者的觀察，有待進一步深入。本實驗中COH大鼠經過中藥經后增殖方干預后，卵巢組織中凋亡因子 Fas，Fasl，Caspase?8，Caspase?3基因及蛋白表達均下降，且中藥組與空白組之間差異無統計學意義，說明中藥經后增殖方可下調Fas通路關鍵凋亡因子的表達水平，抑制超排卵大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的發生，并且可使其接近于自然排卵大鼠狀態，從而提高卵母細胞質量，改善卵泡質量和胚胎發育潛能。本實驗對前期研究進行了進一步的補充，為臨床運用中藥經后增殖方改善卵母細胞質量提供科學的實驗依據。

綜上所述，中藥經后增殖方能下調超排卵大鼠卵巢顆粒細胞Fas凋亡通路上關鍵因子基因及其蛋白的表達，抑制顆粒細胞凋亡，因此，推測Fas通路可能是經后增殖方改善卵母細胞質量的作用靶點之一。

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