人羊膜間充質干細胞不同移植方式治療大鼠脊髓損傷療效比較

馬晶晶 廖旭勇 趙玉潔 喻皇飛

1遵義醫學院第三附屬醫院檢驗科（遵義 563000）；2遵義醫學院第一附屬醫院檢驗科（遵義 563000）；3遵義醫學院第三附屬醫院腫瘤科（遵義 563000）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經系統的嚴重性疾病之一，具有高發病率、高致殘率和高病死率的特點［1］。目前無SCI特異性治療手段，手術僅對壓迫性及嵌頓性SCI有一定效果，某些激素如甲基強的松龍的治療效果也非常有限。干細胞移植作為SCI的潛在治療策略之一，備受學術界的廣泛關注［2-3］。目前用于SCI治療研究的干細胞類型有胚胎干細胞（ESCs）、誘導多能干細胞（iPSCs）、神經干細胞（NSCs）和間充質干細胞（MSCs）等。ESCs和iPSCs盡管分化潛能廣，卻存在致瘤隱患［4］。相比之下，NSCs和MSCs是較為理想的兩種干細胞類型，但MSCs具有廣泛的組織學來源，且有免疫調節和細胞因子分泌功能，一直是SCI再生策略研究的熱點［5-6］。在不同組織來源的MSCs中，人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）具有多系分化特性，低免疫原性，擴增能力強、不牽涉倫理問題等優勢，是理想的供源細胞類型［7］。此外，我們之前的研究顯示hAMSCs具有對SCI修復的作用［8-9］。而對于SCI的臨床治療而言，原位移植可能有誘發損傷脊髓的再次損傷、出血等風險，能否通過改變移植途徑的方式更加有利于SCI的治療是我們所關心的問題。故本研究擬通過比較經原位和靜脈途徑移植hAMSCs對SCI大鼠神經功能和組織學修復的效果，探討hAMSCs經靜脈注射途徑治療SCI的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 （1）人胎盤組織：經知情同意后，無菌采集足月分娩胎盤，HbsAg（-），采集后2 h內進入實驗程序。（2）實驗動物：清潔級成年雌性SD大鼠28只，體質量（220±20）g，購自重慶第三軍醫大學動物實驗中心。（3）主要試劑：LG?DMEM培養基、胎牛血清和膠原酶Ⅱ（Gibco公司），胰酶（Amresco公司），流式熒光抗體（BD公司），抗CD68、GFAP及NeuN抗體（millipore公司），熒光標記二抗（Santa Cruz公司）；流式細胞儀（BD公司）；透射電鏡（Hitachi公司）。

1.2 hAMSCs的分離培養 機械分離羊膜，剪碎，用0.05%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37℃消化羊膜碎片30 min，未消化的組織碎片加入0.75 mg/mL的膠原酶消化提取hAMSCs。LG?DMEM完全培養基培養所分離的hAMSCs細胞。取第3代細胞經DAPI標記后用于細胞移植。

1.3 hAMSCs的表型鑒定 調整細胞濃度至1×106/mL，取細胞懸液200 μL分別加入相應熒光標記抗體各3 μL，混勻室溫避光孵育20 min，PBS充分洗滌重懸后，流式細胞儀檢測分析。同型對照為熒光素標記的小鼠IgG。

1.4 SCI模型建立和細胞移植 SD大鼠28只，分為hAMSCs原位移植組，原位移植對照組，hAMSCs移植注射組（靜脈移植對照組，每組各7只。大鼠麻醉后，充分顯露T11段脊髓，用手術刀片快速橫斷并往返復切3次，將兩斷端輕輕提起以證實完全切斷脊髓，逐層縫合傷口。1周后再次暴露損傷脊髓組織，用微量注射器將預備的細胞懸液緩慢注入到脊髓兩斷端的灰白質交界處，退針前留針5 min。而靜脈移植組大鼠則通過尾靜脈注射相同數量的細胞懸液。對照組以PBS替代。術后截癱護理，定時協助受試大鼠排尿排便。

1.5 行為學評價 采用BBB評分法［10］。細胞移植后每周一次對大鼠進行后肢功能測評，共分22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分。每次測評均在同一時點進行，觀察時間為5 min，測評前排空膀胱。

1.6 組織學檢測 實驗截止時處死的各組大鼠，取出損傷段脊髓，置于30%蔗糖4℃固定后切片，行組織學檢測：（1）HE染色，觀察組織結構；（2）免疫熒光染色：切片洗滌封閉后分別滴加NeuN（1∶100）、GFAP（1∶200）、CD68（1∶100）抗體，對照組用PBS替代一抗，4°C過夜，洗滌后滴加相應熒光二抗室溫孵育2 h，充分洗滌后封片觀察；（3）透射電鏡觀察髓鞘形態：組織經戊二醛和四氧化鋨固定后，環氧樹脂包埋，切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色觀察。

1.7 統計學方法 數據以均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析。組間差異比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.01表示差異有顯著意義。

2 結果

2.1 hAMSCs形態觀察 原代培養的hAMSCs 12 h即有部分細胞貼壁，3 d后貼壁細胞迅速增多，由圓形，卵圓形轉變為梭形、多角形生長（圖1A）。傳代培養3 d后hAMSCs融合近95%以上，細胞呈長梭形、紡錘形，單層漩渦放射狀生長（圖1B）。

圖1 hAMSCs生長形態（×200）Fig.1 Morphology of cultured hAMSCs（× 200）

2.2 hAMSCs表型鑒定 FCM分析結果表明，培養的hAMSCs高表達典型MSCs表面標記，如CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，幾乎不表達CD80、CD86、CD45、CD34及HLA?DR（圖2）。

圖2 流式細胞術分析hAMSCs表型Fig.2 Phenotypic analysis of hAMSCs by FCM

2.3 SCI大鼠行為學觀察 BBB評分如圖3所示，hAMSCs移植后1周，原位移植組大鼠和尾靜脈移植組大鼠的BBB評分分別是3.50±1.48、2.64±0.74，兩組之間比較無統計學差異，但與同時點PBS組大鼠的分值（分別是0.71±0.67、0.86±0.61）相比，差異有顯著意義（均P＜0.05）；從術后1周到第6周，無論是移植組還是相應對照組大鼠BBB評分均有升高趨勢，但前兩組上升幅度明顯高于對照組。至第6周，原位移植組大鼠和尾靜脈移植組大鼠BBB分值分別達6.71±0.70和6.93±1.28，均高于相應時點的PBS對照組評分（均P＜0.05），而原位移植組和尾靜脈移植組之間比較差異仍無統計學意義。

圖3 hAMSCs移植后各組大鼠BBB分值變化Fig.3 BBB scores in rats of different groups with SCI after hAMSCs transplantation

2.4 hAMSCs的體內植活 hAMSCs移植后第6周，無論是原位移植組還是尾靜脈移植組大鼠損傷脊髓節段組織切片中均可見DAPI標記陽性細胞存在（圖4A、B）。原位移植組中DAPI陽性細胞主要沿針道注射處分布于脊髓灰白質組織之中，相對較集中（圖4A）；而尾靜脈移植組DAPI陽性細胞散在分布于組織中（圖4B）。

圖4 hAMSCs在大鼠受損脊髓組織內的植活（×100）Fig.4 Survival of hAMSCs in injured spinal cord of rats after transplantation（× 100）

2.5 損傷脊髓組織學觀察 HE染色結果顯示（圖5），hAMSCs移植后第6周，原位移植組、尾靜脈移植組大鼠橫斷損傷區上下兩殘端脊髓組織得以有效整合連接，連接處見各種細胞增生，排列紊亂無規則。同時也有少量小的空洞形成，可見炎細胞浸潤（圖5A、C）。PBS對照組大鼠SCI區組織呈現較大的空洞及明顯的囊腔并伴隨細胞的紊亂排列，損傷脊髓段中間幾乎未見組織結構相連，僅在其兩側有少許組織得以連接兩殘端組織（圖5B、D）。

2.6 損傷脊髓組織免疫熒光染色 免疫熒光染色結果顯示（圖6），hAMSCs細胞移植第6周，hAM?SCs原位移植組和尾靜脈移植組在損傷脊髓組織可見大量NeuN染色陽性神經細胞，而PBS對照組脊髓組織中的NeuN陽性細胞明顯減少。GFAP陽性神經纖維在hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植組損傷段脊髓組織中的表達相似，呈細絲狀均質散在分布；而其在相應的PBS對照組大鼠的受損脊髓則呈集束狀，形狀粗大，相互匯集纏繞，主要分布于受損脊髓段的空洞和囊腔邊緣；CD68的表達分布與GFAP頗為相似，主要集中受損脊髓囊腔和空洞邊緣，在hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植組，CD68陽性細胞在損傷段脊髓組織內呈均勻散在分布，未見明顯聚集成簇現象。

2.7 損傷脊髓組織髓鞘觀察 如圖7顯示，脊髓損傷hAMSCs細胞移植后第6周，hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植脊髓組織中見部分板層松懈，但髓鞘結構規則完整，呈圓形或卵圓形（圖7A、C）。而在PBS對照組中，損傷段脊髓組織均可見大量形態異常的髓鞘結構，髓鞘板層結構嚴重松解、扭曲，整體呈空泡化改變明顯，部分髓鞘結構高度水腫變形，甚至崩解，以原位移植對照組更甚（圖7B、D）。

3 討論

盡管MSCs移植治療SCI具有廣闊的應用前景，但也存在著很多問題需要關注和探索。除了供源細胞的組織學來源、類型和分化潛能外，合適的、方便快捷的移植途徑更符合臨床需求。我們之前的研究首次證實了hAMSCs原位移植具有對SCI大鼠組織學修復和神經功能重建的能力［8-9］，在本研究中，我們發現靜脈移植hAMSCs對SCI大鼠的神經功能和組織結構同樣具有修復作用。hAMSCs能夠在移植后第6周的脊髓損傷段組織中植活，說明靜脈移植hAMSCs仍可遷徙到病損組織。hAMSCs這種能力和其本身固有的低免疫原性不無關系［11］。由于不表達CD80、CD86和HLA?DR等多種免疫相關分子，hAMSCs移植后不引起宿主的排異，能夠通過體循環定植于損傷部位發揮修復作用的特點，是hAMSCs作為供源細胞的優勢之一。

在實驗中，我們觀察到hAMSCs移植后NeuN陽性表達神經元細胞明顯增多。而GFAP陽性神經纖維在對照組損傷端變形打結，而在移植組卻均勻分布的現象充分說明hAMSCs移植不僅利于促進神經元細胞的存活，還可通過抑制膠質細胞增生減少膠質瘢痕的形成。此外，我們還觀察了CD68陽性小膠質細胞在PBS組脊髓缺損殘端聚集。研究顯示，在SCI后損傷早期，小膠質細胞活化，釋放白細胞介素、TNF等大量細胞因子加重炎癥反應，對神經元產生毒害作用。而在晚期小膠質細胞又可通過清除細胞間的毒素并分泌神經營養因子起到神經保護作用［12］。鑒于小膠質細胞在神經組織損傷修復過程中的作用，結合我們的結果，我們懷疑hAMSCs移植可調控小膠質細胞的生物學行為，減輕了其對神經元的毒害作用，使得損傷后組織向有利于修復的方向轉化。

對于MSCs移植促進SCI組織和功能修復的機制尚不清楚，目前認為主要有以下幾種方式：（1）MSCS在微環境作用分化成神經元細胞發揮神經傳導替代作用，有助于神經功能的修復［13］；（2）MSCS通過分泌多種神經營養因子及細胞因子，進而改善神經功能［14］；（3）MSCs通過某種方式激活神經組織預存的NSCs，調節組織再生修復［15］。（4）移植的MSCs形成有益微環境，引導軸突生長以促進神經系統的修復［16］。理論上講，經不同途徑植入hAMSCs，可能會由于作用機制的不同，所產生的治療效果亦存在一定差異。而我們的結果卻顯示，兩種移植方式無論在組織學修復還是神經功能改善的程度上有著相似的效果，說明靜脈移植途徑同樣是hAMSCs治療SCI的有效途徑的同時，也提示著這兩種方式有著相似的修復機制。研究顯示，hAMSCs可以分泌血管內皮生長因子、神經生長因子、神經營養素3、腦鈉素、腦源性神經營養因子等多種細胞因子和營養因子參與神經細胞的存活，遷移或分化［17］。大量營養因子或細胞因子的分泌又可改善機體損傷后的整體狀態和局部微環境［18］，這可能是靜脈移植途徑具有原位移植相同修復效果的機制之一。而hAMSCs究竟產生了哪些因子參與SCI的修復，則是我們下一步需要深入的研究的內容。

圖7 損傷段脊髓組織中髓鞘形態（×5 000）Fig.7 Morphology of medullary sheath in injured spinal cord（×5 000）

參考文獻

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