左卡尼汀對感染性休克患者血小板及線粒體的影響

李力 汪峰

九江學院附屬醫院1重癥醫學科，2普外科（332000九江）

膿毒癥導致對器官功能衰竭的發病機制尚不明確。有研究認為，感染所引起的全身炎癥反應可抑制線粒體功能，導致組織器官沒有足夠的能量來維持正常的功能，機體處于低代謝狀態甚至器官衰竭。然而從人體臟器獲取線粒體很難實現。但是循環血液中的血小板線粒體含量豐富，甚至在危重患者中也容易獲得。并且血小板線粒體功能可以用不同技術方法進行檢測。也可作為線粒體靶向治療藥物效果的評估。本研究通過監測血小板水平以及血小板線粒體功能，來判斷左卡尼汀注射液對膿毒癥患者血小板的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年12月至2016年11月在我院ICU住院的膿毒癥患者62例，其中男35例、女27例，年齡27～76歲。將患者隨機分為兩組，各31例，兩組患者的性別、年齡無統計學意義，具有可比性。

1.2 診斷及納入標準 所有患者均符合2014年《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》關于膿毒癥診斷標準，ICU住院時間超過7 d。排除標準：（1）既往有慢性器官功能損害患者，如慢性腎衰竭、肝硬化、慢性呼吸衰竭等；（2）惡性腫瘤患者；（3）自身免疫系統疾病患者；（4）確診后7 d內自動出院或死亡患者；（5）存在明確藥物過敏的患者；（6）用藥劑量不足或療程不足7 d、檢測指標不全、及治療期間輸注血小板；（7）近2周用過影響血小板的藥物，如阿司匹林、血寧片等等。

1.3 治療方法 采用前瞻性開放式完全隨機對照試驗，將63例患者隨機分為治療組和對照組。對照組：參考《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》采取常規集束化治療方案。治療組：在常規集束化治療方案基礎上，加用左卡尼汀注射液（常州蘭陵制藥有限公司生產）4 g加入生理鹽水100 mL靜脈滴注，每日1次，每次滴注時間約30 min，持續用藥7 d。

1.4 樣本處理 兩組患者分別于治療前及治療第3、7 d留取新鮮靜脈血樣5 mL，干燥采血管中加入50 U/mL肝素抗凝處理。用生理鹽水等倍稀釋后，經Percoll（1.06 g/mL）密度梯度離心法（20℃，2 000 r/min，7 min）取F2白色絮狀層，PBS冷凍洗滌3遍以上即得到分離純化的血小板備用。

1.5 檢測指標 血小板數量的檢測：所有患者分別于入院時、入院后3、7 d抽取新鮮靜脈血樣送檢驗科檢測血小板數值。血小板線粒體通透性轉變孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的檢測：在細胞正常狀態時，Calcein可進入線粒體內發出綠色強熒光，僅在細胞線粒體膜受損后，通透性轉變孔開放的情況下，CoCl2可進入線粒體內淬滅該熒光。因此，該技術可用于判斷細胞內線粒體通透性轉變孔的開放程度，間接判斷線粒體是否損傷。以Calcein?AM與CoCl2共同孵育血小板15 min，冷凍PBS洗滌后，采用流式細胞儀（BD FACS CotoⅡTM）進行定量檢測，以細胞平均綠色熒光強度衡量線粒體通透性轉變孔的狀態。血小板線粒體跨膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）檢測：采用JC?1染色方法鑒定細胞內線粒體跨膜電位ΔΨm的變化。以JC?1孵育血小板15 min后，PBS冷凍洗滌，采用流式細胞儀進行定量檢測，以綠色熒光（低ΔΨm細胞）所占百分比衡量血小板線粒體去極化的百分數。血小板線粒體內三磷酸腺苷（ATP）含量檢測：以熒光素-熒光素酶法檢測血小板線粒體ATP水平，血小板懸液（2×106/mL）與檢測試劑等比混合，室溫孵育15 min，采用Spectra Max M5酶標儀檢測熒光強度（RLU）。

1.6 統計學方法 采用SPSS統計軟件對數據進行統計學處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，分析比較兩組數據間方差齊性，方差齊則組間比較采用等方差樣本SNK檢驗，方差不齊則組間比較采用異方差樣本Dunnetts′C檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血小板數量的比較 兩組患者在入院時血小板數值差異無統計學意義，入院后3 d治療組患者血小板數值仍低于入院時數值，而入院后7 d患者血小板數值高于入院時數值差異均有統計學意義（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者血小板數值均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血小板數量比較Tab.1 Comparison of platelet count ±s

表1 血小板數量比較Tab.1 Comparison of platelet count ±s

注：與同組入院時比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時78.42±2.34 78.34±3.40入院3 d 51.32±2.45 62.33±2.43*#入院7 d 64.52±5.36 91.41±4.23*#

2.2 兩組血小板線粒體通透性轉變孔的變化 兩組患者在入院時Calcein值差異無統計學意義，入院后7 d患者Calcein值高于入院時，差異有統計學意義（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者Calcein值均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 血小板線粒體通透性轉變孔變化比較Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

表2 血小板線粒體通透性轉變孔變化比較Tab.2 Comparison of the changes of mPTP ±s

注：與同組入院時比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時197.32±56.19 196.63±53.74入院3 d 165.53±42.13 185.12±51.82#入院7 d 187.34±35.41 234.24±40.67*#

2.3 兩組血小板線粒體膜電位的變化 兩組治療前低線粒體膜電位細胞含量比較差異無統計學意義，入院后3 d及入院后7 d治療組患者低線粒體膜電位細胞含量較治療前降低（P＜0.05）；入院后3 d及入院后7 d治療組患者低線粒體膜電位細胞含量均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表3 血小板線粒體膜電位下降分布率比較Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

表3 血小板線粒體膜電位下降分布率比較Tab.3 Comparison of the decreasing distribution rate of MMP±s，%

注：與同組入院時比較，*P＜0.05；與對照組同日比較；#P＜0.05

組別對照組治療組入院時34.42±3.27 34.33±4.51入院3 d 37.01±5.13 32.33±2.12*#入院7 d 32.23±3.27 23.85±4.43*#

2.4 兩組血小板線粒體內ATP水平的變化 兩組治療前血小板內ATP相對含量比較差異無統計學意義，入院后3 d及入院后7 d治療組患者血小板內ATP水平均較治療前均增高（P＜0.05），入院后3、7 d治療組患者Calcein值均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表4。

3 討論

膿毒癥是宿主對感染的反應失控導致危及生命的器官功能衰竭［1］。其主要特征是線粒體功能障礙，而線粒體功能降低在MODS的發生、發展及功能恢復中起關鍵性作用［2-3］。在膿毒癥早期即出現線粒體對氧利用障礙［4］。隨著膿毒癥病情的進展，線粒體功能及數量均下降，為了適應線粒體能量供應，組織器官通過降低或關閉細胞功能來減少能量需求，從而形成一個新的供需平衡即器官功能障礙（MODS）［5］。如果嚴重膿毒癥持續時間過長，線粒體結構和功能將呈現不可逆性的改變，最終導致線粒體功能衰竭，細胞能量枯竭，引起器官功能衰竭而死亡。

左卡尼汀即左旋肉堿是哺乳動物能量代謝中必需的體內天然物質。對線粒體功能的改善有重要作用：（1）左卡尼汀通過乙酰肉堿轉移酶的活動，參與在脂酰肉堿和脂酰?CoA酯之間平衡的建立這對維持線粒體功能至關重要［6］；（2）左卡尼汀通過維持能量代謝相關酶以及氧化磷酸化的線粒體關鍵酶的活性穩定線粒體膜［7-8］，并改善受損線粒體超微結構、維持線粒體長度、減少線粒體損傷的數量，從而阻止細胞凋亡［9］；（3）左卡尼汀對于線粒體功能損傷的保護也有抗氧化和抗炎的機制參與［10-12］。在代謝應激時，線粒體積累脂酰?COA，是為了保持機體卡尼汀穩態。足夠量的游離卡尼汀可促使堆積的脂酰?CoA進入線粒體內，使氧化磷酸化得以順利進行。還能增加NADH細胞色素C還原酶、細胞色素氧化酶的活性、加速ATP的產生，從而提高組織細胞能量供應，阻止器官功能衰竭。

通過對在醫院ICU 62例膿毒血癥患者研究顯示，加用左卡尼汀治療的患者和常規治療患者在入院時血小板數量差異無統計學意義，而入院后7 d，加用左卡尼汀治療的患者血小板數量不僅較治療前高，還高于常規治療患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且左卡尼汀組患者Calcein值同樣高于常規治療患者和治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）；而左卡尼汀治療的患者入院后3、7 d低線粒體膜電位細胞含量均較治療前降低（P＜0.05），且下降程度均高于對照組（P＜0.05）；左卡尼汀治療的患者血小板內ATP含量同樣是入院后3、7 d均較治療前明顯升高（P＜0.05），且均高于對照組（P＜0.05）。說明左卡尼汀可明顯改善線粒體膜通透性及膜電位，使線粒體功能恢復，從而增加血小板能量供應，阻止血小板凋亡。

綜上所述，應用左卡尼汀注射液4 g靜脈滴注能夠有效改善膿毒癥休克患者血小板線粒體結構和功能，并阻止血小板凋亡。

表4 血小板細胞內ATP含量的變化Tab.4 Changes of ATP content in platelet

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