3種甲基化抑制劑對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及愈傷誘導(dǎo)的影響

賈永紅，劉 聰，高 婧，韓丹丹，李樹梅

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000）

苜蓿（Medicago sativa L.）作為牧草之王，不僅飼用價(jià)值高，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，而且還可以加工成高蛋白人類營(yíng)養(yǎng)保健食品，此外苜蓿富含各種維生素、礦物質(zhì)及類胡蘿卜素、類黃酮素和酚型酸，具有良好的藥用價(jià)值，全草入藥，有助于人體健康的恢復(fù)；苜蓿還是防風(fēng)固沙和綠化荒山的優(yōu)良作物，具有很高的環(huán)保價(jià)值。苜蓿在地球上分布廣泛，除野生種外，世界各國(guó)都有栽培，目前對(duì)苜蓿的遺傳改良也成為一大研究熱點(diǎn)。

DNA甲基化（DNA methylation）是目前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，DNA甲基化是基因組遺傳信息的重要組成，在維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)基因活性以及生長(zhǎng)發(fā)育中基因的表達(dá)調(diào)控方面起重要作用［1－2］，甲基化水平過(guò)低或過(guò)高，都會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和分化，導(dǎo)致發(fā)育和形態(tài)異常［3］。

本研究在培養(yǎng)基中添加甲基化抑制劑，觀察其在生長(zhǎng)發(fā)育和再生過(guò)程中的效應(yīng)，以期為苜蓿遺傳改良和表觀遺傳研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

1.1.1植物材料 中苜1號(hào)種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，選取其無(wú)菌苗的下胚軸和子葉。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基所用試劑、甘露醇、乙醇、氯化汞等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭恢参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、5－氮雜胞苷（5－azacytidine，5－azaC）、姜黃素均為生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)口分裝試劑，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配成1 000×貯液－20℃保存；5－azaC和姜黃素配成10 mmol／L溶液－20℃保存。

種子培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基（含30 g／L蔗糖和8 g／L瓊脂），分別添加不同濃度的甘露醇、5－azaC、姜黃素。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS＋UM有機(jī) ＋2 mg／L 2，4－D＋0.25 mg／L 6－BA＋30 g／L蔗糖 ＋8 g／L瓊脂粉 ＋2 g／L水解酪蛋白（UM有機(jī)包含10 mg／L鹽酸硫胺素、10 mg／L鹽酸吡哆醇、5 mg／L煙酸、2 mg／L甘氨酸、100 mg／L肌醇），分別添加不同濃度的甘露醇、5－azaC、姜黃素。

其中，甘露醇在滅菌前直接加入培養(yǎng)基中，使終濃度分別為 0、50、100、150、200 mmol／L，滅菌后使用；5－azaC和姜黃素經(jīng)抽濾滅菌后，分別在培養(yǎng)基滅菌后降溫至60℃以下時(shí)加入，使終濃度依次為 0、10、25、50、100μmol／L，搖勻后分裝。3種甲基化抑制劑按濃度從低到高依次標(biāo)記為CK（0添加）、B1、B2、B3、B4。

1.2 方法

挑選飽滿無(wú)損傷的種子，流水下沖洗30 min，在70%的乙醇中振蕩1 min，換入0.1%的氯化汞中振蕩消毒8 min，再用無(wú)菌水沖洗5～7次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，接種于添加有不同濃度甘露醇、姜黃素和5－azaC的MS培養(yǎng)基上，每一種甲基化抑制劑每濃度梯度重復(fù)4瓶（其中1瓶作為備用樣品，另作標(biāo)記，只有當(dāng)某一供試樣品污染或發(fā)生異常時(shí)用備用樣品代替），每瓶30粒左右；置于（24±1）℃、光照度25μmol／（m2·s）、光暗周期比為16 h∶8 h的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察種子萌發(fā)情況和無(wú)菌苗的長(zhǎng)勢(shì)，分別統(tǒng)計(jì)8 d時(shí)的發(fā)芽率、無(wú)菌苗根長(zhǎng)度、整株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。

同法在無(wú)添加甲基化抑制劑的MS培養(yǎng)基中，接種苜蓿種子培養(yǎng)，觀察無(wú)菌苗的長(zhǎng)勢(shì)，待子葉展開即可剪取子葉和下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)和愈傷誘導(dǎo)。

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的5～6 d無(wú)菌苗的子葉（從基部切下）、下胚軸切段（3～5 mm）為外植體，分別接種到添加不同濃度梯度甲基化抑制劑的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每一種甲基化抑制劑每一濃度梯度接種子葉外植體和下胚軸外植體各10瓶，每瓶5～8塊。培養(yǎng)瓶置于（24±1）℃、光照度25μmol／（m2·s）、光暗周期比為16 h∶8 h的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定時(shí)觀察，及時(shí)清理污染的培養(yǎng)基，觀察并記錄下胚軸和子葉開始出現(xiàn)第1塊愈傷組織的時(shí)間，并于20 d后統(tǒng)計(jì)下胚軸和子葉的愈傷誘導(dǎo)情況，計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率。

對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，SNK法對(duì)差異達(dá)顯著水平的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲基化抑制劑對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的影響

經(jīng)消毒的苜蓿種子接種于添加有不同濃度甘露醇、姜黃素和5－azaC的MS培養(yǎng)基上，4～5 d即可發(fā)芽（圖1），分別統(tǒng)計(jì)8 d時(shí)每濃度梯度各3瓶的發(fā)芽種子數(shù)和未發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算得到發(fā)芽率，以及每一處理組的平均發(fā)芽率（表1），利用方差分析和多重比較方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除姜黃素10μmol／L處理組苜蓿種子發(fā)芽率極顯著高于其他姜黃素濃度組和對(duì)照組外（P＜0.01），其他甲基化抑制劑及其他各濃度處理，并未引起苜蓿種子發(fā)芽率的顯著變化（P＞0.05），只是隨各種試劑濃度增加表現(xiàn)出發(fā)芽率降低的趨勢(shì)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 甲基化抑制劑對(duì)苜蓿無(wú)菌苗生長(zhǎng)的影響

接種后8 d，可發(fā)芽的種子都已發(fā)芽成苗，部分已經(jīng)長(zhǎng)出真葉，須根極少或沒(méi)有，取出無(wú)菌苗，測(cè)量每一株的根長(zhǎng)度，每一瓶無(wú)菌苗的數(shù)量、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（80℃烘干至恒質(zhì)量），計(jì)算每一培養(yǎng)瓶中無(wú)菌苗的平均根長(zhǎng)度、單株平均鮮質(zhì)量和單株平均干質(zhì)量，以及每一處理濃度組的平均值，結(jié)果見表1。

對(duì)各組根長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，甘露醇和5－azaC各處理組與對(duì)照組彼此差異均不顯著（P＞0.05），且苜蓿無(wú)菌苗根長(zhǎng)未表現(xiàn)出隨濃度變化的規(guī)律性變化，姜黃素處理組苜蓿苗根長(zhǎng)均極顯著小于對(duì)照組（P＜0.01），10μmol／L處理組苜蓿苗根長(zhǎng)顯著大于100μmol／L處理組（P＜0.05）。

各組的單株干鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果表明，5－azaC各處理組單株鮮質(zhì)量均低于對(duì)照組，且隨處理濃度變化，單株鮮質(zhì)量呈現(xiàn)鐘形曲線變化，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）；添加甘露醇有使無(wú)菌苗鮮質(zhì)量降低的趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比達(dá)到極顯著差異水平（P＜0.01），而各處理濃度組之間苜蓿無(wú)菌苗單株鮮質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；姜黃素的添加使苜蓿單株鮮質(zhì)量極顯著降低（P＜0.01），且低濃度組（10μmol／L）單株鮮質(zhì)量顯著大于高濃度組（50、100μmol／L）（P＜0.05），而中高濃度處理組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3種甲基化抑制劑處理得到的無(wú)菌苗單株平均干質(zhì)量與對(duì)應(yīng)試劑各處理組鮮質(zhì)量有相似的變化趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著差異水平（P＞0.05）。

2.3 甲基化抑制劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別統(tǒng)計(jì)下胚軸和子葉作為外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)（圖2）的數(shù)據(jù)，由表1可知，經(jīng)方差分析和多重比較，結(jié)果表明，添加5－azaC后，下胚軸愈傷誘導(dǎo)率呈現(xiàn)隨添加濃度升高而降低的趨勢(shì)，除低濃度（10μmol／L）處理組與對(duì)照組差異不顯著外（P＞0.05），中高濃度（25～100μmol／L）處理組下胚軸愈傷誘導(dǎo)率極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），100μmol／L處理組下胚軸愈傷誘導(dǎo)率顯著或極顯著低于對(duì)照組和其他處理濃度組（P＜0.05）；添加甘露醇除高濃度（200 mmol／L）處理組下胚軸愈傷誘導(dǎo)率極顯著低于對(duì)照組和低濃度（50 mmol／L）處理組外（P＜0.01），其余各處理組及對(duì)照組間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；添加低濃度（10μmol／L）姜黃素可促進(jìn)下胚軸愈傷組織的形成，愈傷誘導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但隨添加濃度的增加，下胚軸愈傷誘導(dǎo)率急劇降低，直至高濃度（100μmol／L）完全抑制愈傷組織的形成，各濃度梯度間呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）。

添加5－azaC使子葉愈傷誘導(dǎo)率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但除高濃度處理組（100μmol／L）顯著低于無(wú)添加的對(duì)照組外（P＜0.05），其余各處理組間相比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；添加甘露醇也使子葉愈傷誘導(dǎo)率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；添加姜黃素誘導(dǎo)子葉愈傷組織，也呈現(xiàn)出與下胚軸愈傷誘導(dǎo)相似的傾向，同樣在高濃度完全不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，對(duì)照組、低濃度組（10μmol／L）和中濃度組（25μmol／L）三者之間愈傷誘導(dǎo)率均無(wú)顯著差異（P＞0.05），三者愈傷誘導(dǎo)率極顯著高于高濃度（50～100μmol／L）添加組（P＜0.01）。

表1 添加甲基化抑制劑對(duì)苜蓿生長(zhǎng)及再生的影響

3 討論

DNA甲基化能夠?qū)е轮参锉碛^形態(tài)改變，形成可遺傳的表型性狀［4］。DNA甲基化水平的升高或降低對(duì)植物的一些重要性狀會(huì)產(chǎn)生極為重要的影響。非生物脅迫能夠造成全基因組或特定位點(diǎn)胞嘧啶甲基化水平的升高或降低［3，5］，甚至?xí)绊懙街参锏拿庖呖剐裕?］。

5－azaC是一種研究和應(yīng)用較多的DNA甲基化抑制劑，可以降低基因組甲基化水平［7］。5－azaC還可發(fā)揮植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑效應(yīng)，誘導(dǎo)植物開花［8－9］。研究表明，5－azaC使紫花苜蓿幼苗高度和干質(zhì)量、鮮質(zhì)量降低［10］，雖未發(fā)現(xiàn)基因甲基化狀態(tài)明顯改變，但高濃度的5－azaC會(huì)抑制愈傷組織的增殖和再分化［11］。本研究結(jié)果也表明，添加5－azaC使無(wú)菌苗根長(zhǎng)和單株平均鮮質(zhì)量下降，但未達(dá)到顯著差異水平；而在離體組織培養(yǎng)中，愈傷誘導(dǎo)率隨5－azaC添加濃度的增加而逐漸降低，甚至呈現(xiàn)出極顯著差異，支持Brown等的結(jié)論［11］。

姜黃素（curcumin）對(duì) DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1（DNA methyltransferase，DNMT1）有明顯的抑制作用，是最新發(fā)現(xiàn)的一類甲基化抑制劑，用于白血病細(xì)胞株系基因組DNA的研究，發(fā)現(xiàn)濃度為3.0～30.0μmol／L的姜黃素可導(dǎo)致 DNA甲基化水平降低15%～20%［12］，此外姜黃素具有清除自由基、抑菌抗炎、抗增殖、抗腫瘤等廣泛的藥理作用［13－14］。本研究結(jié)果表明，低濃度姜黃素可提高苜蓿種子發(fā)芽率，也可提高離體子葉和下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率，但隨姜黃素添加濃度升高愈傷誘導(dǎo)率急劇下降，至濃度升高到100μmol／L時(shí)，完全不形成愈傷；同時(shí)添加姜黃素使苜蓿無(wú)菌苗根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量隨其添加濃度增加而迅速下降，甚至達(dá)到顯著或極顯著差異水平。

甘露醇（mannitol）常被用作組織液吸收劑，作為植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)的水分脅迫因子，是一種植物組織相容性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，甘露醇處理能明顯地提高大麥花粉粒存活率和質(zhì)量，有利于進(jìn)一步分裂形成愈傷組織和胚狀體；還能明顯提高大麥花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率及綠苗產(chǎn)量［15－18］。植物組織培養(yǎng)中添加一定濃度的甘露醇可以抑制植物的生長(zhǎng)，高滲透脅迫能夠影響植物DNA甲基化狀態(tài)［19］，甘露醇處理影響DNA甲基化水平和模式改變，呈現(xiàn)表觀遺傳變異。有研究表明，甘露醇處理使擬南芥幼苗基因組DNA的甲基化狀態(tài)發(fā)生了不同程度的變化，50～200 mmol／L甘露醇可使擬南芥基因組CCGG位點(diǎn)發(fā)生雙鏈半甲基化（mCCGG）以至雙鏈全甲基化（CmCGG），濃度375 mmol／L以上甘露醇處理組幼苗全部死亡［20］。本研究結(jié)果也顯示，添加甘露醇使苜蓿種子發(fā)芽率、無(wú)菌苗根長(zhǎng)、單株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，但只有單株鮮質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高濃度的甘露醇還可極顯著降低苜蓿下胚軸的愈傷形成，對(duì)苜蓿子葉影響較為溫和。

由此可見，3種甲基化抑制劑均可不同程度地對(duì)苜蓿種子的萌發(fā)、無(wú)菌苗的生長(zhǎng)以及愈傷組織形成產(chǎn)生抑制效應(yīng)，其中高濃度姜黃素對(duì)苜蓿無(wú)菌苗的生長(zhǎng)以及外植體愈傷誘導(dǎo)的抑制效應(yīng)最為突出，然而其低濃度又對(duì)苜蓿種子的萌發(fā)和外植體愈傷的誘導(dǎo)表現(xiàn)某種程度的促進(jìn)作用。

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