促紅細(xì)胞生成素對早期外傷性癲大鼠的保護作用及對bcl-2和caspase-10表達(dá)的影響

王 文，喬 偉，杜 陳，黃其軍，石全紅,謝延風(fēng)，馮愛平

材料與方法

1 研究對象

體重為(250±15)g左右的30只雄性SD大鼠作為本文的研究對象。并按照隨機數(shù)字表法分成實驗組、模型組以及對照組3組，每組各10只。本次實驗，采用購于美國Sigma公司的FeCl3溶液；1500IU/0.5mL重組人促紅細(xì)胞生成素(r-HuEPO)注射液購于沈陽三生制藥股份有限公司；美國Proteintech Group公司的caspase-10兔多克隆抗體，Abcam公司的bcl-2兔單克隆抗體；日本TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol RNA抽提試劑；北京六合華大基因科技公司合成的PCR引物、北京中杉金橋公司β-肌動蛋白(actin)鼠多克隆抗體。

2 FeCl3外傷性癲模型的制作及觀察

3 標(biāo)本采集

傷后24h，通過腹腔注射水合氯醛的方式，對大鼠進行麻醉，斷頭取腦，然后對左側(cè)大腦皮層注射區(qū)域標(biāo)本進行分離。從構(gòu)成上看，各個標(biāo)本都涉及兩部分內(nèi)容，都需要進行3次沖洗，分別是DEPC水和4℃ PBS緩沖液。沖洗后，將標(biāo)本置于-80℃的環(huán)境下進行保存。

4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測bcl-2和caspase-10 mRNA表達(dá)

取約80mg腦組織標(biāo)本，參照說明書提取總RNA(Trizol法)，微量分光光度計(美國BIO-RAD公司)檢測RNA樣品濃度(A值)及純度(A260/A280值在1.7～2.0)并進行標(biāo)化。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參照進行實時定量PCR反應(yīng)(美國BIO-RAD公司的IQ5 RT-PCR儀)。25μL反應(yīng)體系中包含12.5μL SYBR GREEN，10μLPCR水，0.25μL上游引物，0.25μL下游引物和2μL cDNA。引物序列見表1。反應(yīng)條件如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，40個循環(huán)。PCR結(jié)果采用Ct值比較相對定量法，β-actin為內(nèi)參照。

表1 實時定量PCR引物序列

5 Western blotting檢測bcl-2和caspase-10蛋白表達(dá)

對總蛋白質(zhì)按照說明書標(biāo)準(zhǔn)進行提取，同樣地，對其濃度情況用BCA法進行檢測。以β-actin為內(nèi)參蛋白，選取一些蛋白樣品進行如下操作，將水煮沸，將已經(jīng)經(jīng)過變性緩沖液沖洗的樣品放入其中，繼續(xù)蒸煮5min；緊接著，再進行5min的10 000r/min離心，并在此基礎(chǔ)上上樣。電泳、轉(zhuǎn)膜后，在4℃封閉環(huán)境中，將經(jīng)過5%脫脂牛奶處理過的硝酸纖維膜放置并過夜；在此基礎(chǔ)上，再加入3類不同的抗體孵育過夜，即抗β-actin抗體、抗caspase-10抗體、抗bcl-2抗體。在實驗中，主要通過Image J來檢測蛋白定量情況。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 行為學(xué)觀察

2 RT-PCR結(jié)果

模型組和實驗組bcl-2的mRNA表達(dá)均較對照組下降，實驗組較模型組增高(P<0.05)。模型組和實驗組caspase-10的mRNA表達(dá)均較對照組增高，實驗組較模型組下降(P<0.05)。見表3。

3 Western blotting結(jié)果

模型組和實驗組bcl-2的蛋白表達(dá)均較對照組下降(P<0.05)，實驗組bcl-2的蛋白表達(dá)較模型組增高(P<0.05)。見表3、圖1。

模型組和實驗組caspase-10的蛋白表達(dá)均較對照組增高，實驗組caspase-10的蛋白表達(dá)較模型組下降(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 大鼠癲發(fā)作行為學(xué)表現(xiàn)

表2 大鼠癲發(fā)作行為學(xué)表現(xiàn)

組別n平均發(fā)作次數(shù)(次)平均每次持續(xù)時間(min)模型組108 83±1 472 14±0 57實驗組103 62±1 05?1 24±0 17?

經(jīng)t檢驗，與模型組比較：*P<0.05

表3 大鼠皮層bcl-2、caspase-10 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

經(jīng)LSD-t檢驗，與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖1 Western blottin顯示bcl-2蛋白的表達(dá)。

1.對照組；2.模型組；3.實驗組

圖2 Western blottin顯示caspase-10蛋白的表達(dá)。

1.對照組；2.模型組；3.實驗組

討 論

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