干酪乳桿菌細(xì)菌素的抗菌機(jī)制分析

馬佳歌，于 微*，李佳君，周詩昊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在食品加工及貯運(yùn)過程中，腐敗菌和致病微生物的生長繁殖會(huì)嚴(yán)重威脅食品安全。食品安全與人類健康息息相關(guān)，開發(fā)可靠、有效的天然防腐劑是目前亟待解決的問題。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類化合物，產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌存在免疫特性，不會(huì)傷害菌株本身[1-3]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）被美國食品與藥品監(jiān)督管理局公認(rèn)為安全的一種益生菌[4-6]，其所產(chǎn)的細(xì)菌素具有安全無毒等特性[7-8]。目前商業(yè)化的乳酸菌細(xì)菌素Nisin由于熱不穩(wěn)定、抑菌譜窄、pH值范圍窄、產(chǎn)量低等原因，在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制[9-10]，因此，開發(fā)一種應(yīng)用范圍廣闊的新型生物防腐劑備受關(guān)注，干酪乳桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素作為一種新型乳酸菌細(xì)菌素受到廣泛重視[11-13]。

課題組前期從發(fā)酵乳制品中分離出具有抑菌活性的干酪乳桿菌KLDS 1.0338，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增出class IIb細(xì)菌素編碼基因lacA和lacB，利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有酶切位點(diǎn)的重組細(xì)菌素基因，從而構(gòu)建克隆質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析干酪乳桿菌細(xì)菌素基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及特征功能，采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建重組細(xì)菌素突變載體，分析細(xì)菌素突變體抗菌活性，推測(cè)干酪乳桿菌細(xì)菌素發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為進(jìn)一步探索干酪乳桿菌細(xì)菌素抗菌機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

干酪乳桿菌KLDS1.0338由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌（Escherichia coli BL21）感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 試劑

溶菌酶、凝血酶、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Tris-base上海陽光生物科技有限公司；Triton-X 上海索寶生物科技有限公司；溴酚藍(lán) 北京百奧萊博科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 上海寶曼生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker寶生物（大連）有限公司；GST融合蛋白純化試劑盒美國Axygen公司；QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒 美國Stratagene公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ULT1386-3-V30超低溫冰箱 日本Sanyo公司；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；T-Gradient 96 Thermoblock Modul PCR儀 德國Biometra公司；WH-851旋渦混合器 上海科達(dá)測(cè)試儀器廠；CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日公司；Z300-K冷凍離心機(jī)德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的編碼干酪乳桿菌細(xì)菌素class IIb類型的相關(guān)基因序列，應(yīng)用DNAMAN軟件分別將細(xì)菌素lacA和lacB的核酸序列翻譯成氨基酸序列，獲得蛋白質(zhì)的基本信息。利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白組學(xué)分析平臺(tái)（ExPASy）ProtParam tool在線程序（http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析[14]；使用ProtScale 軟件（http://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的疏水性和親水性[15]；利用網(wǎng)址http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化分析；利用TMHMM Server v.2.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA程序（http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用CBS中的SignalP 4.1 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽[16]；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用http://swissmodel.expasy.org/分析。

1.3.2 細(xì)菌素突變表達(dá)載體構(gòu)建

依據(jù)細(xì)菌素LacA和LacB的生物信息學(xué)分析結(jié)果和細(xì)菌素第2類型（class IIb）抑菌結(jié)構(gòu)GxxxG，選擇LacA蛋白中40位V和57位I為突變位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，并設(shè)計(jì)突變引物，分別是P1/P2和P3/P4。將實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-lacAB作為氨基酸定點(diǎn)突變的DNA模板，氨基酸定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增體系（50.0 μL）：ddH2O 35.5 μL，10×Taq DNA polymerase buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，DNA模板1.0 μL，10 μmol/L上游引物2.0 μL，10 μmol/L下游引物2.0 μL，2.5 U/μL Taq DNA polymerase 0.5 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，68 ℃延伸2 min/kb，30 個(gè)循環(huán)。按照QuikChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒的實(shí)驗(yàn)操作方法，稍作改動(dòng)[17]。

酶切鑒定：PCR產(chǎn)物冰上孵育5 min，使其溫度降至37 ℃以下，用1 μL Dpn I酶單酶切，37 ℃過夜反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

引物如下（下劃線位點(diǎn)為堿基突變處）：

P1：5-CGATCGGGGGAGCGGCAGCAGGCGCAGCTGG-3

P2：5-CCAGCTGCGCCTGCTGCCGCTCCCCCGATCG-3

P3：5-GTTGCAGGCGCTGCAGCAGGATTATCCTTGTG-3

P4：5-CACAAGGATAATCCTGCTGCAGCGCCTGCAAC-3

1.3.3 細(xì)菌素突變體的表達(dá)及純化

經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的突變載體涂布于LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，按1∶50的比例（200 μL）接種于10 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)培，使菌液OD600nm達(dá)0.8（使大腸桿菌處于最適合表達(dá)外源蛋白的生長狀態(tài)）。加入IPTG后，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h。5 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，充分洗滌數(shù)次并以8 000 r/min離心2 min。向收集到的菌體中加入細(xì)菌裂解液，于4 ℃裂解10 min。

將重組蛋白與GSH-Sepharose 4B懸液混合，于室溫作用10 min離心，將懸液全部加入離心柱上，經(jīng)漂洗和重復(fù)洗脫，得到純化的重組蛋白。采用凝血酶切割重組融合蛋白后，用GST純化試劑盒純化去除標(biāo)簽，從而獲得單一的目的蛋白LacAB。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)純化效果。

1.3.4 細(xì)菌素突變體抑菌活性檢測(cè)

牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[18-19]：選擇金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌ATCC25922為指示菌種，將過夜培養(yǎng)的指示菌懸液均勻涂于NB平板上，無菌條件下干燥30 min后，將內(nèi)徑為6 mm的牛津杯均勻放置在NB平板上，牛津杯孔內(nèi)滴入200 μL上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，以抑菌圈直徑大小表示抑菌活性強(qiáng)弱[20]。

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法：將指示菌37 ℃培養(yǎng)至菌落數(shù)達(dá)到106CFU/mL，取1 mL指示菌懸液，加入適量含重組細(xì)菌素溶液，至細(xì)菌素終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃共同培養(yǎng)6 h后，用生理鹽水適當(dāng)稀釋菌液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算活菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素生物信息學(xué)分析

2.1.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用Primer 5.0軟件推測(cè)lacA開放閱讀框編碼的蛋白如下：MISKEVGITLKQHDLVLIQRGAKRRNKPSGCIVS TIGGAVAGAAGLNPFTTVAGAAIGLSLCLSTNYIHPA。由蛋白質(zhì)一級(jí)序列分析可知：氨基酸殘基數(shù)為71，其中包含有8 個(gè)堿性氨基酸R 、K、H，1個(gè)酸性氨基酸D，26 個(gè)親水性氨基酸 D、E、H、K、Q、R、S、T、N，34 個(gè)疏水性氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W、Y。

利用Primer 5.0軟件推測(cè)lacB開放閱讀框編碼的蛋白如下：MSYNYRQGLDDFQLSGVSGGKKKFDCAATFY TGITDGIGSGTITGLAGGPFGIIGGAVVGGNLGAVGSA IKCLGDGMQ。由蛋白質(zhì)一級(jí)序列分析可知：氨基酸殘基數(shù)為77，其中包含有5 個(gè)堿性氨基酸R、K、H，5 個(gè)酸性氨基酸D，23 個(gè)親水性氨基酸D、E、H、K、Q、R、S、T、N，31 個(gè)疏水性氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W、Y。

2.1.2 理化性質(zhì)分析

通過ProtParam分析干酪乳桿菌細(xì)菌素（class IIb）中LacA和LacB兩段氨基酸序列（表1）。依據(jù)穩(wěn)定指數(shù)小于40，親水性平均系數(shù)為正值且脂肪指數(shù)較高，推測(cè)LacA和LacB屬于穩(wěn)定、耐熱、疏水性蛋白[21]。

表1 干酪乳桿菌細(xì)菌素氨基酸序列分析結(jié)果Table 1 Amino acid sequence analysis of bacteriocin from Lactobacillus casei

2.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用TMHMM2.0預(yù)測(cè)干酪乳桿菌細(xì)菌素的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，LacA、LacB蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，符合細(xì)菌素跨過細(xì)胞膜分泌蛋白的作用，同時(shí)這也與細(xì)菌素與靶細(xì)胞膜上的特殊位點(diǎn)相互作用相一致，這種作用可以提高細(xì)菌素的有效活性。

圖1 LacA（A）和LacB（B）的跨膜區(qū)分析Fig. 1 Analysis of transmembrane area

2.1.4 磷酸化位點(diǎn)分析

應(yīng)用NetPhos2.0 Server預(yù)測(cè)細(xì)菌素蛋白序列中Ser、Thr和Tyr三種氨基酸殘基可能成為的磷酸化位點(diǎn)，如圖2所示，分析結(jié)果表明LacA中有1 個(gè)Thr氨基酸殘基磷酸化位點(diǎn)，LacB中無磷酸化位點(diǎn)。由此說明，LacA翻譯后進(jìn)行修飾，推測(cè)出該蛋白序列的修飾使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有利于提高抗菌肽活性。

圖2 LacA（A）和LacB（B）的磷酸化位點(diǎn)分析Fig. 2 Analysis of phosphorylation sites

2.1.5 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，其長度約5～30 個(gè)氨基酸，這類肽段通常不能存在于成熟蛋白中。如圖3所示，LacA的C值、Y值和S值分別在52、33、30位點(diǎn)，分別為0.362、0.508、0.911，預(yù)測(cè)含有信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于28～29氨基酸殘基之間。LacB的C值、Y值和S值分別在29、29、19位點(diǎn)，分別為0.415、0.610、0.933，預(yù)測(cè)含有信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于32～33氨基酸殘基之間。

圖3 LacA（A）和LacB（B）的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of signal peptide

2.1.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

二級(jí)結(jié)構(gòu)中LacA以無規(guī)則卷曲為主，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲分別占23.94%、19.72%、56.34%；LacB以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊和無規(guī)則卷曲的比例分別為37.66%、62.34%。結(jié)果顯示LacA和LacB具備抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)[22]。

利用Espasy工具中的SWISS-MODLE軟件對(duì)干酪乳桿菌細(xì)菌素LacA和LacB蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，如圖4所示。LacA主要由兩端松散肽鏈和中間的α-螺旋構(gòu)成（圖4A），α-螺旋結(jié)構(gòu)中存在GxxxG結(jié)構(gòu)域[23-24]，LacB有兩個(gè)反向的β-折疊和一個(gè)α-螺旋，并且兩個(gè)β-折疊由一段松散肽鏈組成的鉸鏈區(qū)連接（圖4B）。

圖4 LacA（A） 和LacB（B）的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 4 Predicted tertiary structure of bacteriocin

2.2 氨基酸定點(diǎn)突變

2.2.1 突變載體的PCR擴(kuò)增

圖5 細(xì)菌素突變載體PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 Results of PCR amplification of mutant bacteriocin

圖6 細(xì)菌素突變載體1（A）和突變載體2（B）測(cè)序結(jié)果Fig. 6 Sequence of mutant plasmid vectors

分別以P1/P2、P3/P4為引物，用實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建好的細(xì)菌素表達(dá)載體為模板，進(jìn)行細(xì)菌素突變載體的PCR擴(kuò)增，如圖5所示。將突變載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，如圖6所示，結(jié)果表明目的蛋白突變位點(diǎn)發(fā)生改變，其余各點(diǎn)均未發(fā)生改變，說明突變載體構(gòu)建成功。

2.2.2 細(xì)菌素突變體的誘導(dǎo)表達(dá)

圖7 細(xì)菌素突變體1誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 7 SDS-PAGE analysis of induced expression of mutant bacteriocin 1

以突變體1為代表，如圖7所示，表明已成功誘導(dǎo)表達(dá)出突變體細(xì)菌素蛋白，氨基酸定點(diǎn)突變沒有改變其表達(dá)條件與特性。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，誘導(dǎo)的重組蛋白增加一條47 ku的蛋白條帶，正好是空載體和目的蛋白之和，說明重組蛋白能在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，氨基酸定點(diǎn)突變沒有改變其表達(dá)條件與特性。

2.2.3 細(xì)菌素突變體的純化

圖8 突變體1細(xì)菌素純化SDS-PAGEFig. 8 SDS-PAGE analysis of purified recombinant mutant bacteriocin 1

將誘導(dǎo)表達(dá)出的突變體細(xì)菌素按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行純化，加入凝血酶切除GST標(biāo)簽，通過洗脫液將目的蛋白從純化柱上洗脫下來，如圖8所示。泳道2與未突變的重組細(xì)菌素基本一致，凝血酶切掉了大部分GST標(biāo)簽，但仍有部分帶標(biāo)簽的突變體細(xì)菌素沒有被完全切開。經(jīng)牛血清白蛋白濃度測(cè)定，突變體1和2的質(zhì)量濃度分別為1.78 mg/mL和1.82 mg/mL，與未突變重組細(xì)菌素質(zhì)量濃度很接近，說明氨基酸定點(diǎn)突變未影響突變體細(xì)菌素的表達(dá)。

2.2.4 細(xì)菌素突變體的抑菌活性

表2 牛津杯瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)突變體細(xì)菌素抑菌活性Table 2 Antimicrobial spectrum and activity of mutant bacteriocins

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)突變體細(xì)菌素抑菌活性，結(jié)果如表2所示。正常未突變的細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌活性，而突變體1和2對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無明顯的抑菌圈。結(jié)果表明，兩個(gè)突變體均因?yàn)榘被岬亩c(diǎn)突變而失去了抑菌活性。

表3 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法檢測(cè)突變體細(xì)菌素抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of mutant bacteriocins

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法檢測(cè)突變體細(xì)菌素對(duì)抑菌活性的影響，以不加細(xì)菌素作為陰性對(duì)照，如表3所示。結(jié)果表明，突變體1和2這兩組的活菌數(shù)顯著大于正常細(xì)菌素組，與陰性對(duì)照組活菌數(shù)無顯著性差異，這說明本實(shí)驗(yàn)所突變的兩個(gè)氨基酸均對(duì)重組細(xì)菌素的抗菌活性有關(guān)鍵性的作用，且這兩個(gè)氨基酸突變?nèi)我庖粋€(gè)均會(huì)導(dǎo)致重組細(xì)菌素失活。

3 結(jié) 論

利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因和蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析，建立理論模型，尋找新型細(xì)菌素成為可能[25-27]。分析獲得干酪乳桿菌細(xì)菌素LacA蛋白具有松散-螺旋-松散的結(jié)構(gòu)，LacB蛋白具有折疊-鉸鏈區(qū)-折疊的結(jié)構(gòu)，以及明顯的跨膜區(qū)域，符合class II細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特征，穩(wěn)定、耐熱和疏水的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征是細(xì)菌素發(fā)揮抑菌作用所必需的。

通過干酪乳桿菌細(xì)菌素結(jié)構(gòu)分析，細(xì)菌素存在GxxxG結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)代表跨膜螺旋[28-29]，在LacA中α-螺旋涉及GxxxG結(jié)構(gòu)，推測(cè)LacA中第38～42位氨基酸的GAVAG序列和第54～58位氨基酸的GAAIG序列均對(duì)細(xì)菌素的抑菌活性有關(guān)鍵作用。

體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相互作用的主要方法[30]，同時(shí)也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)。采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)，選擇LacA蛋白氨基酸序列中的第40位的V和第57位的I，結(jié)果表明突變重組細(xì)菌素失去抑菌活性，無明顯抑菌效果，推測(cè)V40和I57是重組細(xì)菌素發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。說明這兩個(gè)位點(diǎn)及其構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)菌素發(fā)揮抗菌活性的必要性，需要兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域同時(shí)正確，細(xì)菌素才能發(fā)揮抑菌活性。

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