ε-聚賴氨酸復配防腐劑在醬腌菜中的應用

宋 萌，付 強，時藝翡，程雅文，鄭佐興，譚之磊*，賈士儒*

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

醬腌菜是深受我國人民喜愛的一種佐餐小菜，具有悠久的歷史，因其美味、脆爽而受到廣大消費者的青睞[1]。美中不足的是醬腌菜中的食鹽含量較高，如果長期食用含鹽量高的食品會對身體造成負面影響[2]。如今，飲食健康和食品安全引起了人們的重視，全世界都在提倡低鹽飲食[3-4]。利用鹽漬方法來延長保質期已經不再符合人們的飲食觀念，因此引發醬腌菜的防腐保鮮問題[5-6]。近幾年在各地的醬腌菜抽查報告中，不合格樣品屢屢被檢出，為了防止微生物超標而超劑量使用防腐劑是其主要原因[7]。因此，在保證低鹽醬腌菜品質的同時，如何安全、規范地使用防腐劑來延長其保質期成為了醬腌菜行業中亟待解決的問題[8-9]。目前，生物防腐劑如ε-聚賴氨酸（ε-ploy-L-lysine，ε-PL）、乳酸鏈球菌素（Nisin）、納他霉素等已經成為國內外食品安全領域的研究熱點[10]。ε-PL是一種具陽離子賴氨酸同聚物，并且具有抑菌譜廣、抑菌pH值范圍寬、水溶性好、安全性和熱穩定性高[11-12]等特點，可作為食品防腐劑廣泛使用[13-14]。Nisin是一種天然抗菌肽，是目前研究最廣泛的細菌素[15]，可有效地抑制革蘭氏陽性細菌以及產芽孢的枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長[16-17]。納他霉素是一種多烯烴大環內酯類抗真菌劑，對霉菌、酵母菌、某些原生動物和某些藻類有抑制作用，但是它沒有抗細菌活性[18]，可以和Nisin抑菌譜互補，在奶酪、臘腸和飼料等食品中的應用廣泛[19]，是為數不多的被美國食品藥品監督管理局推薦的生物防腐劑；茶多酚是茶葉中酚類物質和其衍生物的總稱，具有良好的抗氧化、抗衰老、抗癌變、抗輻射、防腐保鮮、抑菌除臭等功能[20]，往往用于食品的保鮮、保色劑，抑菌除臭劑等[21-23]。目前，茶多酚在食品貯藏保鮮中往往和其他添加劑復配使用，以延長食品貨架期[24-25]。

本研究以ε-PL、Nisin、納他霉素和茶多酚進行復配，利用響應面法優化防腐劑配比，旨在有效延長醬腌菜的存儲時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

供試菌株由市售醬腌菜中篩選出的腐敗細菌、腐敗酵母菌（經分子生物學方法鑒定分別為Bacillus subtilis、B. thuringiensis、Candida parapsilosis、Fusarium oxysporum、Trichosporon montevideense）。

1.1.2 試劑

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、Nisin、納他霉素 浙江新銀象生物工程有限公司；茶多酚 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.4±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min；固體培養基加20.0 g/L瓊脂。YPD培養基：酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，pH 6.0±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min；固體培養基加20.0 g/L 瓊脂。PCA培養基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸膏2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，瓊脂15 g/L。pH 7.0±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min。煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：蛋白胨10.0 g/L，乳糖10.0 g/L，牛膽粉溶液200 mL，0.1 g/100 mL煌綠溶液13.3 mL，pH 7.2±0.1，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

卡盒式SpectraMax Paradigm多功能酶標儀 美谷分子儀器上海有限公司；Uvmini-1240型紫外分光光度計蘇州島津儀器有限公司；CRH-250-S型恒溫培養箱廣東省醫療器械廠；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將從醬腌菜中分離出的腐敗細菌挑取一環至無菌LB培養基中，37 ℃、180 r/min培養至OD600nm0.2～0.5備用；挑取一環腐敗酵母菌，接種至無菌YPD培養基中，28 ℃、180 r/min培養至OD600nm0.3～0.4備用。

1.3.2 混合微生物的制備

為模擬食品中的微生物環境，將分離出的腐敗微生物混合制成混合腐敗微生物。方法如下：將每種細菌分別接種到5 mL無菌LB培養基中37 ℃培養12 h；腐敗酵母菌接種到5mL無菌YPD培養基中，30 ℃培養48 h后，每管取1 mL菌懸液9 000×g離心10 min，再用無菌生理鹽水（9 g/L）洗滌沉淀，然后用0.5 mL的無菌生理鹽水重懸浮沉淀，分別得到107CFU/mL的腐敗細菌和腐敗酵母菌[26]。將細菌和酵母菌的重懸液分別等比例混合，得到腐敗細菌和腐敗酵母菌混合微生物樣品備用。

1.3.3 單一防腐劑抑菌效果實驗

不同質量濃度的單一防腐劑制備：參照GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中食品添加劑最大允許使用范圍，分別制備含不同質量濃度的ε-PL（0、15、30、60、100、150、250、500 μg/mL）、Nisin（0、15、30、60、100、150、250、500 μg/mL）、茶多酚（0、15、30、60、150、300、400、500 μg/mL）、山梨酸鉀（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）、苯甲酸鈉（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）的LB培養基，以及含有不同質量濃度納他霉素（0、10、25、40、50、60、80、100 μg/mL）、山梨酸鉀（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）、苯甲酸鈉（0、50、100、200、400、500、1 000、2 000 μg/mL）的YPD培養基。向每組培養基中接入腐敗微生物后，細菌在37 ℃、180 r/min條件下培養12 h，酵母菌在28 ℃、180 r/min條件下培養24h后，分別測定OD600nm。每組實驗3 次平行，并設置未添加防腐劑的空白對照組。

1.3.4 防腐劑協同抑菌效果評價

采用棋盤式微量液體稀釋法（棋盤法）[27]測試同時使用兩種防腐劑（ε-PL＋Nisin；ε-PL＋茶多酚，Nisin＋茶多酚）時對腐敗菌的抑制效果。其原理是根據分數抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）判斷兩種物質是否存在協同作用。具體評價標準為：FICI≤0.5，表示協同作用；0.5＜FICI≤1，表示相加作用；1＜FICI≤2，表示無關作用；FICI≥2，表示拮抗作用。FICI的計算公式如下：

式中：OIC為同時使用兩種防腐劑時，有抑制效果的實驗組中最小的防腐劑濃度；MIC為防腐劑最小抑菌濃度。

1.3.5 ε-PL復配防腐劑的響應面試驗設計

根據單一防腐劑的抑菌效果實驗結果，設計4因素3水平響應面，根據其水平設計，采用不同ε-PL（A）、Nisin（B）、納他霉素（C）與茶多酚（D）用量，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

根據Design-Expert 8.0.6 trial軟件進行Box-Behnken設計得到29 組試驗，其中每組試驗設3 組平行，以菌落總數為響應值（Y），試驗結果經Design-Expert 8.0.6 trial軟件分析得到響應值與4因素的回歸方程，Y極值即為預期菌落總數值，所對應的4因素取值即為復配防腐劑中各組分最佳配比。

1.3.6 醬腌菜的制作工藝

干制蘿卜浸泡時，蘿卜要完全浸沒水中（蘿卜-水質量比1∶10）；調味料與復水蘿卜之間比例（質量分數）：白糖1%、食鹽4%、雞精0.3%、辣椒油6%～8%。同時設置未添加復配防腐劑的空白對照組，并按照GB 2760—2014最大允許使用量同時添加山梨酸鉀和苯甲酸鈉的化學防腐劑對照組。

1.3.7 保質期的確定

按照1.3.6節的方法將制作好的醬腌菜樣品用無菌包裝袋進行分裝，扎緊袋口，每份樣品25 g，置于37 ℃培養箱進行加速實驗。每隔3 d對醬腌菜樣品進行取樣，檢測微生物菌落總數、大腸菌群數、總酸含量以及氨基酸態氮含量，最后進行感官評價。取樣時若發現樣品出現褐變，發霉或者有異味則說明樣品已經變質。

1.3.8 指標檢測

細菌總數檢測：參照GB 4789—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[28]方法；大腸菌群數量檢測：參照GB 4789.3—2010《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[29]方法；總酸含量檢測：參照譚權涪[30]方法；氨基酸態氮含量檢測：按GB/T 5009.39—2003《醬油衛生的標準分析方法》[31]中4.2節方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 單一防防腐劑抑菌效果

圖1 各防腐劑對腐敗細菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effects of preservatives on bacteria

從圖1可以看出，生物防腐劑比化學防腐劑抑菌效果顯著。苯甲酸鈉和山梨酸鉀是醬腌菜中使用最多的防腐劑，隨著化學防腐劑質量濃度的上升，腐敗菌的生長雖然受到了一定的影響，但是并不能被完全抑制。而單獨添加生物防腐劑ε-PL、Nisin 60 μg/mL時可以完全抑制腐敗細菌B. subtilis和B. thurinqiensis生長，提高用量至100 μg/mL可以完全抑制混合腐敗菌的生長；添加茶多酚30 μg/mL和60 μg/mL時可以分別抑制B. subtilis和B. thurinqiensis生長，提高用量至400 μg/mL時，可以完全抑制混合腐敗菌。因此選擇生物防腐劑不僅安全、高效，而且用量少、更經濟。

圖2 納他霉素對腐敗酵母菌的抑菌效果Fig. 2 Inhibitory effect of natamycin on spoilage yeasts

納他霉素是一種低劑量、安全性高的食品防腐劑，可以廣泛抑制霉菌和酵母菌的生長，從圖2可以看出，在使用納他霉素進行抑菌實驗時，隨著納他霉素質量濃度的增加，腐敗酵母菌OD600nm出現了明顯的下降趨勢，10 μg/mL的納他霉素可以抑制F. oxysporum的生長，納他霉素用量為400 μg/mL時，所有腐敗酵母菌OD600nm幾乎接近于0，對腐敗酵母菌的抑制效果最佳。

2.2 防腐劑協同抑菌效果評價

由于醬腌菜的腐敗主要是由細菌引起，因此考察除納他霉素外，其他3 種防腐劑共同使用時的抑菌效果。將防腐劑兩兩組合進行抑菌實驗，對其協同抑菌效果進行評價，結果見表2。

表2 OIC測定結果Table 2 Determination of OIC

表3 FICI指數測定結果Table 3 FICI values of preservative combinations

根據防腐劑對兩種腐敗細菌的FICI指數測定結果（表3）可以看出，ε-PL和Nisin同時使用時，0.5＜FICI≤1，兩種防腐劑存在相加作用，ε-PL和茶多酚同時使用以及Nisin和茶多酚同時使用時，FICI≤0.5，表明茶多酚和ε-PL或者Nisin同時使用時會有協同增效的結果。因此3 種防腐劑之間存在協同作用，同時使用會增強抑菌效果，減少用量，降低成本。

2.3 響應面法優化復配防腐劑各成分配比

2.3.1 響應面試驗設計及結果

表4 Box-Behnken設計與結果Table 4 Box-Behnken design with response variable

響應面試驗設計與結果見表4。利用Design-Expert 8.0.6 trial軟件對所得數據進行回歸分析，其回歸方程模型如下所示：

Y=7 252.687 50－12.737 50A＋36.927 08B－48.775 00C－31.683 33D＋0.000 625AB－0.125 00AC＋0.015 000AD－0.368 75BC－0.015 500BD－0.054 000CD＋0.036 354A2－0.155 21B2＋1.399 17C2＋0.040 817D2

再進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析與回歸方程系數估計值，如表5所示。此響應面模型為極顯著，失擬項不顯著，可見回歸方程可靠，可進一步分析。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

2.3.2 復配防腐劑各組分配比的確定

根據Box-Behnken試驗所得的結果與回歸方程，利用Design-Expert 8.0.6 trial軟件分析當復配防腐劑中各組分配比為ε-PL 0.06 μg/mL、Nisin 0.06 μg/mL、納他霉素0.035 μg/mL和茶多酚0.40 μg/mL時，菌落總數達到理論最小值1.43×105CFU/100 g，醬腌菜制品衛生標準規定菌落總數小于1～3×106CFU/100 g，可見該預期值有效，符合國標水平。

2.3.3 復配防腐劑驗證結果

為驗證響應面設計配方的可行性，將制作好的醬腌菜進行分裝后，置于室溫條件下，每隔3 d取樣，檢測貯存21 d后的樣品感官質量、微生物菌落總數、大腸菌群數、總酸、氨基酸態氮含量的變化。

圖3 醬腌菜經過不同處理方法后保存21 d的表觀結構Fig. 3 Visual appearance of pickles with different treatments after being stored for 21 days

由圖3可知，醬腌菜放置21 d后空白對照、化學防腐劑、工藝1三組蘿卜顏色變暗、褐變現象明顯，質地軟爛已變質，無鮮香氣味，異味明顯，而工藝2實驗組的醬腌菜具有蘿卜固有的微黃色，無發暗變色現象，無褐變具有咸菜的鮮香氣，無異味，與存放前無差異，味美，質地脆嫩，有效延長了其保質期。

表6 醬腌菜在貯存過程中菌落總數的變化Table 6 Changes in total colony count of pickled radish during storage CFU/g

表7 醬腌菜在貯存過程中大腸菌群數的變化Table 7 Changes in coliform count of pickled radish during storage CFU/g

由表6、7可知，未添加防腐劑的空白對照組在存放6 d后已經變質，按照國標范圍內最大量添加化學防腐劑和復水時添加復配防腐劑的實驗組在存放9 d后變質，只有在拌料時添加復配防腐劑的實驗組（工藝2）菌落總數和大腸桿菌群數量符合國家標準GB 2714—2015《醬腌菜》規定，有效抑制了微生物的增殖。

圖4 醬腌菜在貯存過程中總酸含量的變化Fig. 4 Changes in total acid content of pickled radish during storage

從圖4可以看出，所有實驗組的醬腌菜總酸含量都隨著存放時間延長逐漸增加，由于空白對照組未添加任何防腐劑，其總酸含量增加最快。添加化學防腐劑和蘿卜復水時添加防腐劑的實驗組（工藝1）總酸相比存放前分別增加了58%和55%，增幅較大。醬腌菜中總酸含量增加主要是因為乳酸菌發酵產生乳酸，此外，還可能還有一些酵母菌發酵產生了丁酸等一些酸性物質，使醬腌菜pH值降低。從圖4可以看出，拌料時添加復配防腐劑可以有效減緩產品中總酸含量的增加，保證醬腌菜的口感。

從圖5可以看出，氨基酸態氮（以氮計）隨著醬腌菜存放時間的延長總體呈現下降的趨勢。其中只有在拌料時加復配防腐劑的實驗組（工藝2）氨基酸態氮含量下降緩慢，其他3 組在存放過程中氨基酸態氮含量下降明顯。氨基酸態氮是由醬腌菜中微生物發酵消耗醬腌菜本身蛋白質所產生的，為微生物的生長代謝提供能量，微生物過度繁殖會導致氨基酸態氮含量降低，破壞醬腌菜的營養價值，生成的代謝副產物也會影響醬腌菜的風味，由圖5可知，拌料時添加復配防腐劑可以有效抑制氨基酸態氮消耗，保證醬腌菜品質。

3 結 論

和醬腌菜中常用的化學防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉相比，生物防腐劑ε-PL、Nisin、納他霉素和抗氧化劑茶多酚對醬腌菜中腐敗微生物抑制作用更加顯著，且它們之間存在協同抗菌效果，同時使用可以提高抑菌性能，減少用量。通過響應面法優化出復配防腐劑各成分用量為ε-PL 0.06 μg/mL、Nisin 0.06 μg/mL、納他霉素0.035 μg/mL和茶多酚0.40 μg/mL。和在干制蘿卜復水時添加復配防腐劑相比，在醬腌菜拌料時添加復配防腐劑可以在加速實驗（37 ℃）條件下延長其保質期至21 d，品質良好，菌落總數、大腸菌群數、總酸以及氨基酸態氮含量均符合國家規定。

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