miR- 200c通過靶向調節AHNAK抑制胰腺癌細胞的侵襲

顧興偉，周家華

(東南大學附屬中大醫院 普外科，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，其發生發展過程受到多種編碼基因與非編碼基因的調控[1]。MicroRNA(miRNAs)是一類小片段(20～22個核苷酸)的非編碼RNA，miRNA的表達失衡對胰腺癌的侵襲轉移具有重要影響[2- 3]。miRNA- 200c屬于miRNA- 200家族，具有調控腫瘤侵襲的作用[4- 5]。已有研究表明，miR- 200c在胰腺癌組織中表達降低[6]。并且胰腺癌干細胞中miR- 200c的表達降低，而miR- 200c過表達能夠抑制胰腺癌干細胞的生長及侵襲[7]。然而關于miR- 200c是否參與調控胰腺癌細胞侵襲及機制仍然有待進一步研究。本研究以胰腺癌細胞SW1990和PANC- 1為研究對象，旨在探討miR- 200c過表達對胰腺癌細胞侵襲的影響，為胰腺癌的防治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人胰腺癌細胞SW1990、PANC- 1購自中國科學院上海細胞所，常規傳代培養；DMEM培養液、胎牛血清及胰酶購自Gibco公司；脂質體轉染Lipofectamine2000、Trizol及PCR擴增試劑盒購自Invitrogen公司；SYBR green PCR mix購自TaKaRa公司；miR- 200c引物、U6引物、miR- 200c類似物(miR- 200c mimics)及其陰性對照(Scramble)購自GenePharma公司；PMSF、RIPA裂解液購自碧云天公司；Matrigel購自BD公司；Super ECL Plus試劑盒、BCA試劑盒購自Pierce公司；AHNAK兔抗人多克隆抗體(sc- 98373)、β- actin兔抗人多克隆抗體(sc- 130656)購自Santa Cruz Biotechnology公司；pmirGLO載體、Dual- luciferase檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 含10%胎牛血清的DMEM培養基中加入合適體積的人胰腺癌細胞SW1990和PANC- 1，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，根據細胞生長密度更換新鮮培養基或傳代培養。

1.2.2 細胞轉染 將以1×105對數期生長的人胰腺癌細胞SW 1990及PANC- 1接種于6孔培養板中，細胞生長密度至60%～70%時，根據脂質體轉染Lipofectamine2000說明書分別轉染miR- 200c mimics及其陰性對照。

1.2.3 RNA提取及RT- PCR 使用Trizol從細胞中分離提取出總RNA。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR green PCR mix在StepOne實時PCR系統(Applied Biosystems)上進行RT- PCR。miR- 200c和U6擴增引物購買自GenePharma公司，其中U6為內參對照，各組相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 Transwell細胞侵襲實驗 按照試劑盒的說明書要求，使用8 μm孔徑的室評估細胞遷移。在Transwell上室中加入100 μl Matrigel，2 h凝固后將含有105個細胞的200 μl無血清DMEM培養基加入Transwell上室中，將含10%FBS的200 μl DMEM培養基加入到下室中。細胞在37 ℃、5%CO2中孵育。培養24 h后用棉簽刮去Transwell上室內的細胞，固定并用0.1%結晶紫染色遷移至膜底部的細胞，通過顯微鏡觀察并計數。

1.2.5 生物信息學方法預測miR- 200c靶基因 采用TargetScan、PicTar和miranda數據庫預測miR- 200c的靶基因，使用miranda數據庫預測靶基因AHNAK的3′非翻譯區(3′UTR)與miR- 200c的結合位點。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗 構建靶基因AHNAK的3′UTR(野生型3′UTR)與miR- 200c的結合位點突變的序列(突變型3′UTR)。AHNAK的野生型或突變型3′UTR亞克隆至pmirGLO載體中，構建pmirGLO- AHNAK- wt和pmirGLO- AHNAK- mut。實驗分為4組：(1)Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt；(2)Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut；(3)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt；(4)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut。在SW1990及PANC- 1細胞中，按照上述分組進行轉染實驗。按照Dual- luciferase試劑盒說明書檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性，海腎螢光素酶活性作為內參對照。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測 用含有PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，利用BCA試劑盒測量蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脫脂牛奶封閉。膜與AHNAK或β- actin抗體4 ℃孵育過夜，再使用辣根過氧化物酶標記的二抗與膜室溫孵育1 h。使用Super ECL Plus試劑盒進行信號檢測，其中β- actin為內參對照。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量數據描述用均數±標準差，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miRNA- 200c的表達

RT- PCR結果顯示，在SW1990與PANC- 1細胞中，相比轉染陰性對照組轉染miR- 200c mimics 24 h后miR- 200c的表達明顯增高，差異具有統計學意義(圖1)。

*與對照組比較，P<0.05

圖1RT-PCR檢測SW1990與PANC-1細胞中miR-200c的相對表達量

Fig1RelativeexpressionofmiR-200cinSW1990andPANC-1cellswasdetectedbyRT-PCRassay

2.2 miR- 200c過表達對胰腺癌細胞侵襲的影響

Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，與對照組相比人胰腺癌細胞株SW1990及PANC- 1過表達miR- 200c后SW1990與PANC- 1細胞的侵襲能力顯著減弱(圖2)。

圖2miR-200c過表達對胰腺癌細胞SW1990及PANC-1侵襲的影響

Fig2EffectsofmiR-200coverexpressiononinvasioninSW1990andPANC-1pancreaticcancercells

2.3 AHNAK是miR- 200c的靶標

生物信息學結果顯示，miR- 200c可特異結合AHNAK 3′UTR區域，結合位點如圖3A所示。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt共轉染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt共轉染至SW1990和PANC- 1細胞，熒光素酶活性顯著降低。但是，與Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut共轉染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut共轉染至SW1990和PANC- 1細胞，熒光素酶活性基本不變(圖3B)。上述結果表明，miR- 200c能夠與AHNAK基因的3′UTR結合。

2.4 miR- 200c過表達對AHNAK蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡檢測結果顯示，在人胰腺癌細胞SW1990和PANC- 1中，與對照組相比過表達miR- 200c能夠顯著抑制AHNAK的蛋白表達(圖4)。

*與對照組比較，P<0.05

圖3miR-200c能夠與AHNAK基因的3′UTR區結合

Fig3MiR-200cspecificallybindsAHNAK3′UTR

圖4miR-200c過表達對胰腺癌細胞SW1990和PANC-1中AHNAK蛋白表達的影響

Fig4EffectsofmiR-200coverexpressiononAHNAKproteinexpressioninSW1990andPANC-1cells

3 討 論

胰腺癌是美國男性和女性癌癥死亡的第4大常見原因[8]。盡管臨床醫師和科學家在不斷地努力，但胰腺癌患者5年生存率仍較低[9]。在2000年至2011年期間，中國男性胰腺癌發病率逐年上升[10]。胰腺癌惡性程度高，在發病早期極易發生局部侵襲和遠處轉移，使得傳統手術、放療以及化療的療效差[11]。近年來的研究發現，microRNA通過與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)相互作用調節基因的表達，在生物體內起到致癌或者抑癌作用[12]。比如，miR- 451通過靶向調節CAB39促進胰腺癌細胞增殖和轉移[13]，發現miR- 1271通過靶向調節ZEB1和TWIST1抑制胰腺癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化[14]。

鈣調蛋白AHNAK亦稱橋粒聯結蛋白(desmoyokin)，在多種細胞類型中表達[15]。最近的證據表明，AHNAK具有促進腫瘤轉移的能力[16]。AHNAK能夠促進偽足形成、細胞遷移和侵襲、增強肌動蛋白活性、誘導上皮間質轉化從而促進細胞轉移[17]。在間皮瘤細胞中，降低AHNAK的表達能顯著降低細胞的遷移和侵襲能力[18]。以上研究成果均表明，AHNAK在腫瘤的遷移與侵襲中發揮著重要的作用。

miR- 200是一類抑制腫瘤的miRNA家族，其包括miR- 200a、miR- 200b、miR- 200c、miR- 141和miR- 429，并參與腫瘤的發生和發展[19]。miR- 200c作為miR- 200家族的重要成員之一，在腫瘤的發生和發展中發揮著重要的作用。miR- 200c可以通過靶向調節Bmi- 1和E2F3抑制腎癌細胞的生長和轉移[20]，而miR- 200c通過靶向調節FN1能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[21- 22]。我們研究結果顯示，在人胰腺癌SW1990和PANC- 1細胞中過表達miR- 200c顯著降低胰腺癌細胞的侵襲能力，并且miR- 200c能夠與AHNAK的3′UTR結合并下調AHNAK的蛋白表達水平。綜上所述，miR- 200c過表達可通過靶向調節AHNAK的蛋白表達而抑制胰腺癌細胞的侵襲。

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