關于131I標記酪氨酸修飾的血管靶向肽GX1用于消化道腫瘤診治的實驗研究

曲士穎，王鐵，黃京偉

(北京朝陽醫院 核醫學科，北京 100020)

胃腸道腫瘤是人類常見的一類惡性腫瘤，而且很多患者發現時就已處于腫瘤的進展期或晚期，加之目前的醫療技術尚缺乏有效的治療對策，故死亡率很高。科學家們也因此在不斷地探索更高效的新的診斷和治療方法[1]。隨著腫瘤生長依靠新生血管生成學說的出現，關于腫瘤新生血管抑制相關的治療方法的研究也應運展開[2]。近年來放射性核素標記小分子多肽輔助腫瘤顯影在腫瘤的診斷與治療中悄然興起，其中包括對治療性放射性核素標記靶向性小肽或單抗進行放射治療的方法[3]。放射性靶向治療是其中的一種，即采用放射性核素標記配體做示蹤劑，使之與高表達的受體或分子結合，可使腫瘤部位顯影并可利用其放射效應對腫瘤細胞進行殺傷[4]。此外，將其與腫瘤導向治療藥物聯合，可以達到增強腫瘤治療療效、降低身體其它部位藥物毒性和不良反應的目的[5]。GX1短肽是一種新近篩選開發出的環狀小肽，其氨基酸序列為CGNSNPKSC。大量的研究結果提示GX1在體內外都具有腫瘤血管內皮細胞靶向性，不失為一種新的腫瘤血管標記配體，可以聯合其他抗腫瘤藥物，在腫瘤的抗血管生成治療領域大展身手[6]。本研究擬合成酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽，探討131I標記該修飾短肽(Tyr- GX1)標記消化道腫瘤的相關分子影像敏感性，為診斷以及進一步開發體外放射治療研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 主要試劑包括：Tyr修飾GX1短肽：為上海吉爾生化公司合成并純化；Iodogen包被管：按照J.M.Walker所述方法制備[7]；Na131I溶液：為北京原子高科股份有限公司生產；單通道γ射線放射性測量儀：為西安志達科技有限公司生產；CRC- 15PET型活度計：為美國CAPINTEC公司生產；SPECT顯像儀：為美國GE公司生產的Millennium Hawkeye VG型雙探頭SPECT顯像儀。

1.1.2 實驗動物 取雌性4～6周Balb/c裸鼠(上海邦耀生物科技有限公司)36只用于試驗研究，于SPF清潔級環境喂養，符合動物實驗質量標準。

1.1.3 細胞與試劑 人結腸癌細胞LOVO，人胃低分化腺癌細胞系SGC7901細胞(均由中科院上海細胞生物研究所提供)，細胞培養使用RPMI- 1640培養液(Hyclone公司)，胎牛血清購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標記方法及放化純測定 應用Iodogen碘標法標記Tyr- GX1短肽。在包被管中迅速按順序依次加入Tyr- GX1短肽(10 μg·20 μl-1)、Na131I溶液(11.1 MBq),在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液控制反應體系體積40 μl，于室溫靜置完成標記。使用紙層析法測定標記產物的標記率和放射化學純度，并計算比活度。丙酮(展開劑Ⅰ)，氨水(展開劑Ⅱ)∶乙醇∶水按照1∶2∶5配制，131I- Tyr- GX1肽的Rf=0.0～0.1，游離131I的Rf=0.8～1.0。

1.2.2 標記率測定 測定其中131I放射性百分率：通過131I- Tyr- GX1肽于室溫下分別與人血清、鼠血清、PBS等溶液混合，分別在0、6、12、24 h測定標記率。

1.2.3 細胞培養與動物模型的建立 腫瘤細胞常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養，觀察細胞生長并取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化后培養基重懸收集離心細胞，洗滌后調整細胞密度用于轉染實驗動物制成荷結腸癌裸鼠、荷胃癌裸鼠等實驗動物模型。具體方法：準備瘤源，將腫瘤組織放置在無菌生理鹽水中，用無菌眼科剪剔除出血及壞死組織，分割成若干小塊，每塊直徑約1 mm備用。麻醉裸鼠，消毒，腹腔注射4%水合氯醛0.1 ml·kg-1，裸鼠四肢緊張度明顯降低，角膜反射遲鈍，皮膚痛覺消失時完成麻醉，取仰臥位固定四肢，75%酒精消毒。將切好備用的腫瘤組織移植到裸鼠體內。

1.2.4 標記肽在荷瘤裸鼠體內的生物學分布 荷人胃癌移植瘤和結腸癌移植瘤裸鼠每種腫瘤設3只一組，共設6組，兩種腫瘤模型合計裸鼠共36只。每只裸鼠通過尾靜脈注射7.4 MBq·200 μl-1的131I- Tyr- GX1肽，于注射后不同時間點處死裸鼠，解剖并取其相關組織稱重、測定放射性計數，經物理衰變校正后計算每克組織百分攝取率(%ID·g-1)和腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比值(T/NT)。

1.2.5 荷瘤裸鼠體內SPECT顯像 荷瘤裸鼠分別經尾靜脈注射11.1 MBq·300 μl-1的131I- Tyr- GX1肽，于注射后不同時間點分別行裸鼠SPECT顯像。利用ROI技術計算不同時相T/NT。

1.3 統計學處理

SPSS 17.0統計軟件包用于相關數據的分析，統計分析采用卡方檢驗、t檢驗以及方差分析等所有統計學檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，即P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 標記肽的標記率與穩定性

用直接標記法標記Tyr- GX1、GX1短肽，測定標記率在90%～97%范圍，無需純化，比活度也滿足成像的需求。通過與生理鹽水和EDTA、新鮮人血清以及半胱氨酸在一定條件下混合，觀察24 h內標記率變化情況，未見各個混合溶液中標記率的明顯變化，提示穩定性良好。詳見表1。

表1標記率與穩定性情況分析

時間點/hRCP/%生理鹽水EDTA血清半胱氨酸09695949669594939512959492952495949095

2.2 24 h顯影結果分析

131I標記Tyr- GX1后經尾靜脈注射入裸鼠體內，分析24 h顯像等結果，探討Tyr- GX1短肽的腫瘤血管靶向性等特征。本研究中荷胃癌動物Tyr- GX1組自8 h開 始，實驗動物右后肢背側荷瘤部位放射性濃聚灶高于心血池本底，隨時間延長逐漸遞增；腫瘤部位和心血池本底放射性比值隨時間遞增。荷結腸癌動物Tyr- GX1組也自8 h開始實驗動物右后肢背側荷瘤部位放射性濃聚灶高于心血池本底，隨時間延長逐漸遞增，到18 h達到高峰后略有下降；腫瘤部位和心血池本底放射性比值始終高于1。結腸癌組T/NT數值持續高于胃癌組。兩種消化道腫瘤的濃聚及達到峰值時間各有特征。詳見表2。

表2Tyr-GX1在胃癌與結腸癌成像中的T/NT水平

時間點/hT/NT胃癌Tyr?GX1結腸癌Tyr?GX180．871．11120．811．22160．821．30241．211．26

2.3 Tyr- GX1對腫瘤血管靶向性的情況

分批處死動物，分別取血、心、肝、腎等不同器官組織樣本，稱重后測量實驗動物體內放射性計數(%ID·g-1)。計算公式：每克組織注射劑量分布(%ID·g-1)=各組織器官的放射性分布(cpm)/各組織器官的重量(g)/注射劑量。本研究中在荷胃癌和結腸癌組，示蹤劑在各器官均顯示出快速清除，其中腎臟的放射性較高，腫瘤組織的放射性也比較高，高于肌肉、腸、甲狀腺和胃。在肝臟、肺臟以及血液中早期放射性濃聚較高，隨時間延長逐漸下降，檢測結果提示甲狀腺的放射性含量在胃癌組和結腸癌組分別是0.08和0.10% ID·g-1。腫瘤組織的放射性在0.5 h分別為1.29和1.31% ID·g-1，24 h降為 0.55和0.42% ID·g-1，是肌肉組織的3～4倍。詳見表3。

3 討 論

放射性標記短肽成像的相關研究是近年來興起的一門新的分支學科，為分子生物學與醫學影像學結合的學科，更先進的造影劑增強劑不斷出現，更先進的成像儀器設備不斷發展，都推動了這個學科的發展，其中放射性核素成像就是一個方面，該領域主要關注腫瘤等疾病的先進診斷、監測和療效評估方法[8]。目前核素標記抗體或者短肽已經成功地在多種腫瘤的顯影診斷或治療領域中得到了應用，因為不同核素具有各自獨特的理化性質，此外它們的獲得難易程度也不盡相同，加之價格等因素，目前臨床中應用的核素包括18F、99Tcm還有131I等等[9]。

表3 Tyr- GX1在荷人源胃癌與結腸癌移植瘤動物體內生物學分布特征 %ID·g-1

消化道腫瘤在內的大多數惡性腫瘤在其生長以及轉移等過程中會需要依賴新生血管的生成，新生的腫瘤血管內皮細胞在其細胞膜上存在的受體分子表達往往出現異常狀態，科學家們則正是利用了這些腫瘤血管內皮細胞表面表達的特異性，不斷在開發血管靶向治療的新方法，比如很多已經應用于臨床治療的腫瘤血管抑制療法、放射性靶向治療等[10]。GX1短肽是一種新近篩選開發出的環狀小肽，其氨基酸序列為CGNSNPKSC,大量的研究結果提示GX1在體內外都具有腫瘤血管內皮細胞靶向性，不失為一種新的腫瘤血管標記配體，可以聯合其他抗腫瘤藥物在腫瘤的抗血管生成治療領域大展身手[11]。然而不同類型的腫瘤細胞表面及新生血管內皮細胞表達整合素受體的水平有很大差異，導致其對GX1短肽的攝取率也存在差異[12]。為此，采用局部修飾、多聚體化或連接耦合劑等方法增加配體與受體的結合力、改善藥代動力學，提高腫瘤的攝取率；對多肽的化學修飾，加快其在正常組織中代謝清除，降低肝臟攝取和提高T/NT的數值[13]。因此本研究即在GX1短肽的環狀二硫鍵外引入Tyr以后，對其進行生物學活性以及腫瘤靶向性等進行分析探討，并使用放射性核素標記該修飾肽，進一步對結腸癌或胃癌的實驗動物體內的生物學分布等情況進行探索。

本次研究結果提示，在荷胃癌和結腸癌組示蹤劑在各器官均快速清除，腎臟的放射性較高，腫瘤組織的放射性也比較高。在肝臟、肺臟以及血液中早期放射性濃聚較高，24 h時檢測結果提示甲狀腺的放射性含量在胃癌組和結腸癌組分別是0.08和0.10% ID·g-1，隨時間延長逐漸下降，提示標記物具有良好的體內穩定性。同時研究結果中還發現，腫瘤組織的放射性在0.5 h分別為1.29和1.31% ID·g-1，24 h降為0.55和0.42% ID·g-1，是肌肉組織的3～4倍。提示131I標記Tyr- GX1具有活體內腫瘤組織血管的靶向性。活體內腫瘤血管具有一定的靶向性，即生物分子進入人或動物體內后會不可避免地與內環境因素相關聯，包括涉及到被相關酶類分解、出現特異性的代謝特征等，另外還能同體內一些分子結合而改變其原有的生物學行為。因此良好的腫瘤血管導向性分子應該以生物學穩定性為基礎，以確保其可以快速從血液中得以清除，減少對正常血管的結合，同時提高靶組織結合率，為相關靶向治療提供良好的基礎[14- 15]。

總之，本研究提示131I標記Tyr- GX1具有良好的體內腫瘤血管靶向性，與腫瘤組織結合率較高，且兩種消化道腫瘤的濃聚及達到峰值時間各有特征。

[參考文獻]

[1] 陳曉宇,黃陳,裘正軍.早期胃癌的治療現狀與進展[J].現代生物醫學進展,2015,15(12):2352- 2354.

[2] 郭振英,曹伯良.血管內皮生長因子及相關促腫瘤血管生成分子及靶向治療[J].中華病理學雜志,2010,39(4):282- 285.

[3] ZHI J L,CHI H C.Peptides as targeting probes against tumor vasculature for diagnosis and drug delivery[J].J Transl Med,2012,10(1):2386- 2398.

[4] 潘中允.放射性核素治療學[M].北京:人民衛生出版社,2006:298- 304.

[5] AVRAM A M.Radioiodine scintigraphy with SPECT/CT:an important diagnostic tool for thyroid cancer staging and risk stratification[J].J Nucl Med Technol,2014,42(3):170- 180.

[6] 李明,殷繼鵬,惠曉麗,等.131I標記Tyr- GX1在荷瘤裸鼠體內分布和顯像研究[J].現代生物醫學進展,2013,13(9):1601- 1604.

[7] WALKER J M.The protein protocols handbook[M].Totowa,NJ:Humana Press Inc,1996:673- 674.

[8] 高文,張東生,劉璐.放射性核素在腫瘤內照射治療領域的應用進展[J].東南大學學報:醫學版,2004,23(5):344- 346.

[9] 楊愛民,于燕,鄧惠興,等.99Tcm- HL91 和 18F-FDG顯像與放療關系的實驗研究[J].國際放射醫學核醫學雜志,2011,35(4):217- 219.

[10] 向敏,朱玲,劉馨,等.抗腫瘤血管生成靶向治療進展[J].現代腫瘤醫學,2014,22(9):2237- 2240.

[11] 劉驚濤,惠曉麗,劉秦元,等.腫瘤血管內皮特異性靶向肽GX1與NGR在胃癌中顯像差異分析[J].現代腫瘤醫學,2014,22(4):729- 732.

[12] 方如塘,惠曉麗,殷繼鵬,等.新生血管特異性結合肽GX1抑制小鼠視網膜新生血管生成的實驗研究[J].陜西醫學雜志,2012,41(10):1275- 1277.

[13] CHEN B,CAO S,ZHANG Y,et al.A novel peptide (GX1) homing to gastric cancer vasculature inhibits angiogenesis and cooperates with TNF alpha in anti- tumor therapy[J].BMC Cell Biol,2009,9(10):63.

[14] De OLIVEIR é A,FAINTUCH B L,TARGINO R C,et al.Evaluation of GX1 and RGD- GX1 peptides as new radiotracers for angiogenesis evaluation in experimental glioma models[J].Amino Acids,2016,48(3):821- 831.

[15] 惠曉麗,劉驚濤,劉洋,等.腫瘤血管內皮特異性靶向肽 GX1 在結腸癌與肺癌中顯像差異分析[J].現代腫瘤醫學,2015,23(13):1783- 1786.