降鈣素基因相關肽和腺苷2A受體在偏頭痛模型大鼠中的表達及作用機制*

母發光 鄒撰 周超然 歐陽穎

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

偏頭痛是一種慢性中樞神經血管性疾病，由于生活環境逐漸改變及精神壓力增大等因素，偏頭痛的發病率逐年增長，并可能嚴重影響患者工作和生活質量。但目前該病發病機制尚未完全研究清楚[1]。三叉神經血管學說在當今學術界對偏頭痛的研究中占主導地位，降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)主要是由三叉神經節的神經末梢分泌、釋放。它是目前所知最強的內源性舒血管物質，CGRP水平與偏頭痛發作明確相關[2]。腺苷是一種重要的神經調質，它的受體(adenosine receptor，AR)包括四種亞型，即為A1R、A2AR、A2BR、A3R。其中，A2AR與偏頭痛的關系最為密切，不同類型的偏頭痛患者的A2AR基因分析，證實該基因的變異可能與偏頭痛的發生有關。A2AR激活后可促進神經元CGRP的釋放，還能增強CGRP對神經突觸間興奮傳遞的易化作用[3]。硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)偏頭痛模型大鼠與人類偏頭痛發作的臨床表現相近，是目前研究偏頭痛發生機制常用實驗動物模型[4]。故本研究通過建立硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)偏頭痛模型大鼠，檢測CGRP及A2AR在模型大鼠三叉神經組織中的表達，以探討偏頭痛的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和試劑

1.1.1 實驗儀器 熒光顯微鏡(日本 Nikon 公司)；X射線攝行暗匣(廣東粵華醫療器械廠)；電泳儀、電泳槽和轉膜系統(美國 Bio-Rad 公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀(美國Media Cybernetics公司)。

1.1.2 實驗試劑 硝酸甘油注射液(北京益民藥業有限公司，產品批號：H11020289)，CGRP受體抗體(博奧森生物技術有限公司，產品批號：bs-10639R)，A2A受體抗體(美國Santa Cruz公司，產品批號：byk-1456R)，BCA蛋白質定量測定試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司，產品批號：P0010S)，細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司，產品批號：P0033)4%多聚甲醛(博士德生物工程有限公司，產品批號：AR1068)，四甲基乙二胺(TEMED)(美國Sigma公司，批號：023k0016)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及動物模型制備 清潔級健康SD雄性大鼠30只，平均體重200±20克，雌雄各半。由四川省醫學科學院.四川省人民醫院動物實驗中心提供，合格許可證號：SYXK(川)2008-110。自由飲食，分籠喂養。將所有大鼠按隨機數字表法隨機分為空白對照組、模型組,每組各10只。模型組按TassorelliCristina法[5]在大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油(NTG)10mg/Kg，空白對照組則生理鹽水(NS)10ml/Kg皮下注射，每周注射1次，共5周。注射NTG約數分鐘的大鼠表現出極度的煩躁不安，并出現耳朵發紅、搔頭、攀爬鼠籠的次數增加甚至咬尾等行為，這些行為約持續3～5小時后逐漸消退，大鼠繼而出現蜷臥，活動明顯減少。空白對照組則僅在注射NS后數分鐘內表現為煩躁不安隨后恢復平靜，無耳紅、搔頭等現象出現。對各組大鼠進行行為學評分，總分達6分或以上的可視為造模成功[6,7]。

1.2.2 標本的采集和處理 兩組大鼠進行行為學評分后，對大鼠予以10%水合氯醛3ml/kg經大鼠腹部注入體內，等待數分鐘將大鼠完全麻醉后固定于手術臺，開顱剝去表面的硬腦膜，將大腦組織翻起，暴露顱底的三叉神經節，取三叉神經節及三叉神經頸復合體部分放入 4% 多聚甲醛中固定，4℃保存；另一部組織液氮保存備用。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 HE染色檢測三叉神經節組織學結構 取出固定液中的三叉神經節組織，依次置于不同濃度的乙醇中脫水，脫水后的將組織用石蠟包埋后制成厚度約5μm的切片。切片經脫蠟、水化，蘇木精復染，鹽酸酒精分色，氨水返藍，脫水，中性樹脂封片。最后在100和400倍光鏡下觀察切片中三叉神經節組織學結構。

1.2.3.2 免疫組化檢測CGRP的表達 將三叉神經節標本,從4%多聚甲醛固定液中取出，脫水，石蠟包埋，切片,將其平展貼于硌礬明膠處理過的載玻片上。作免疫組化時，脫蠟,水化,封閉,修復。滴加兔抗大鼠(CGRP抗體，一抗，1:200)，滴加生物素羊抗兔(二抗，1:200)50μl/切片，滴加約50μl辣根過氧化物酶標記的鏈親和素。DAB顯色，封片。最后把制作好的玻片放在×400光鏡下觀察、采圖(如組圖6)，并使用Image-pro plus 6.0圖像分析系統上對標本進行分析，以分泌CGRP的陽性細胞的平均光密度(OD)來表示CGRP的分布及含量。

1.2.3.3 免疫熒光檢測A2AR的表達 標本制片、水化，滴加山羊血清封閉，加入 1:2000 的A2AR兔多克隆抗體，滴加用FITC標記稀釋(1：100)后的羊抗兔IgG(二抗)，充分反應后封片；將制作好的載玻片放于熒光顯微鏡下用OLYMPUS BX51 觀察拍片，同時用PBS做背景對照，在鏡下表達A2AR的陽性細胞呈現綠色，用藍色熒光染料DAPI特異與神經元DNA結合,明確組織中的神經細胞數及分布情況與表達綠色的A2AR的陽性細胞作對照，最后在×200鏡下記錄每個標本的表達A2AR陽性細胞數，見圖3。

1.2.3.4 Western blot檢測A2ARD的表達 取出液氮中的組織樣本，研缽中攆碎后，用預冷的PBS溶液洗2次；加入10ul/100mg組織蛋白裂解液，再加入lml/l00mg的PMSF，分裝于EP管；置于在冰浴中30min充分裂解蛋白，震蕩儀震蕩混勻；4℃下 11000轉/分，離心10-20min，將上清液分裝于0.5ml EP管中，行SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜、封閉、抗原抗體反應及顯色。重復實驗3次后，使用Quantity One圖像分析軟件測量條帶的光密度值，A2ARD的相對表達豐度則以靶蛋白灰度/β-actin灰度比值表示。

1.3 統計學分析 采用 SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析處理，符合正態分布資料以±s表示，兩組間均數的比較采用t檢驗。取檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三叉神經節組織HE染色結果 模型組和對照組大鼠三叉神經節組織HE染色后光鏡下不同倍數的對照比較，兩組均顯示神經元與神經纖維分布正常、無紊亂，解剖結構完整，無異常改變。提示：模型偏頭痛大鼠三叉神經沒有發生明顯器質性病變，其行為改變可能是功能性的異常引起，見圖1。

圖1 三叉神經組織HE染色Figure 1 HE staining of trigeminal ganglion

2.2 兩組大鼠三叉神經組織中A2AR表達

2.2.1 Western-blot檢測結果模型組與對照組A2AR蛋白表達，模型組A2AR蛋白表達量高于對照組。模型組灰度值高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.2.2 三叉神經組織中A2AR表達Western-blot蛋白定量灰度值測定結果，對照組為(59.48±5.58)%，模型組為(145.96±8.45)%，兩組比較，P<0.01。

2.2.3 三叉神經組織中A2AR表達蛋白免疫熒光測定結果 表示神經細胞中的DNA分布(藍色熒光)情況，綠色熒光部分則表示A2AR在三叉神經各神經元中的表達分布情況。對比觀察兩組綠色熒光部分發現：模型組中的A2AR蛋白所代表的綠色熒光部分面積明顯大于對照組，見圖3。

圖2兩組三叉神經節中A2AR蛋白表達的Western-blot結果

Figure2Theresultofwestern-blottotestexpressionofA2ARinthetwogroups

圖3 免疫熒光檢測大鼠三叉神經節中A2AR蛋白表達情況(n=10,標尺均為40μm)Figure 3 The expression of A2AR protein in immune fluorescence detection in rat trigeminalganglion

2.2.4 通過免疫熒光記錄兩組三叉神經節上A2AR陽性神經元細胞數及CGRP的OD值比較模型組A2AR陽性神經元細胞數與對照組比較，模型組明顯高于對照組P<0.01，差異有統計學意義，模型組CGRP的OD值明顯高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.3 三叉神經組織中CGRP含量免疫組織化學測定(SP法)結果 光鏡觀察顯示對照組中神經元中CGRP含量少，密度低；模型組中CGRP分布豐富，密度高，見圖4。

表1兩組三叉神經節A2AR陽性神經元細胞數及CGRP的OD值比較

Table1ThenumberofA2ARpositiveneuronsintrigemianlganglionindifferentgroups

組別nA2AR細胞數CGRP/OD對照組1535.73±3.680.15±0.022模型組1577.64±3.93*0.41±0.027t30.1527.23PP<0.01P<0.01

圖4 兩組大鼠三叉神經節中CGRP分布情況Figure 4 The distribution of CGRP in trigeminal ganglion of rats in each group(IHC,×400，bar=50μm)注：免疫組化，×400，箭頭所示為CGRP所分布的神經元，標尺=50μm

3 討論

偏頭痛是一種臨床常見的具有明顯家族聚集性的血管-神經性頭痛，發作時為單側或雙側搏動性頭痛且發作頻繁。其的發作機理仍不明確。三叉神經血管學說主要是指中樞血管強烈擴張時，經過一系列病理生理過程，最終導致神經源性炎癥，進而引起偏頭的發作[1.8]。硝酸甘油在體內分解成一氧化氮(NitrcOxide,NO)。NO能激活平滑肌細胞內腺昔酸環化酶,使環鳥苷酸增高,松弛血管平滑肌和使血管舒張,產生即發性頭痛反應,激發三叉神經一血管反射,誘導C-fos的表達,產生遲發性頭痛反應,人類偏頭痛的各種臨床癥狀投影到偏頭痛模型大鼠身上則表現為用前肢抓撓頭、耳紅、咬尾、攀籠、來回走動等行為[9]。本研究中模型組按在大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油(NTG)每周注射1次，5周后出現以上發作。說明模型制作是成功的。本實驗的研究結果發現，模型組和空白組大鼠三叉神經節組織HE染色后光鏡下不同倍數的對照比較，兩組均顯示神經元與神經纖維分布正常、無紊亂，解剖結構完整，無異常改變。提示：模型偏頭痛大鼠三叉神經沒有發生明顯器質性病變，其行為改變可能是功能性的異常引起。

研究偏頭痛相關活性物質表達有助于探究發病機制及藥物研發。目前國內外對CGRP和A2AR兩種活性物質在偏頭痛發病過程中的變化是研究的熱點。A2AR是一種G蛋白偶聯受體，廣泛分布于中樞神經中，它主要是通過與不同種類的G蛋白或蛋白激酶相偶聯，發揮不同的生物學效應[10]。本實驗模型制作成功后，三叉神經節中A2AR蛋白表達的Western-blot量及灰度值、免疫熒光測定、A2AR陽性神經元細胞數的測定結果：模型組A2AR表達量明顯高于對照組大鼠。說明A2AR參與了偏頭痛的發生和發展過程。它可能參與偏頭痛的作用機制是：①可以直接介導促進興奮性氨基酸的釋放，提高神經敏感性，誘發偏頭痛；②與G蛋白(Gs)相偶聯使腺苷環化酶(AC)活性增高，促進cAMP蛋白合成，激活蛋白激酶A(PKA)或激活Ras/Raf-1/MEK/ERK的信號傳導途徑引起硬腦膜血管擴張；③位于大腦皮層突觸前的A2AR激活后可抑制L、N型Ca2+通道，抑制Ca2+的內流，減少細胞內Ca2+濃度，進而可增加興奮性氨基酸的釋放,增強膜的去極化作用使神經元興奮性升高，舒張血管平滑肌,引起偏頭痛[11]。

CGRP它具有介導細胞內第二信使c-AMP的作用，目前已知c-AMP的升高程度與血管舒張反應的強弱強度密切相關，是目前已知腦循環中作用最強的內源性血管舒張肽，是三叉神經微循環激活中的標志物質[12]。三叉神經節CGRP免疫組化表達水平及OD值結果：模型組CGRP及OD值的表達水平明顯高于對照組。說明CGRP也參與了偏頭痛的發生和發展過程。它誘導偏頭痛發生的作用機制主要包括以下幾方面：①三叉神經末梢釋放的CGRP激活神經元中的N、P型電壓敏感性鈣離子通道促進Ca2+內流或細胞膜對Ca2+的通透性，直接引起硬腦膜血管的劇烈擴張[13,14]。鈣離子通道阻滯劑能夠有效抑制腦細胞內的鈣離子釋放與異常的鈣離子內流，舒張血管與平滑肌, 從而解除血管與平滑肌痙攣, 最終達到止痛的目的。②CGRP刺激與其鄰近的肥大細胞，促使肥大細胞脫顆粒作用，繼而誘發神經源性炎癥。除此之外肥大細胞還可以釋放出多種如前列腺素、組胺5-HT等的神經血管活性物質，此過程就如一種正反饋機制引起CGRP在神經元中的持續釋放，從而引起偏頭痛的長期發作[15]。5-HT 受體拮抗藥,作用于中樞神經系統和三叉神經中受體介導的神經通路, 逆轉偏頭痛發作時血中CGRP的增加。通過阻斷神經源性炎癥起到治療偏頭痛的作用。③大量的CGRP 受體存在衛星膠質細胞中,促進衛星膠質細胞激活和提高其致敏的作用，同時會有利于CGRP 本身的合成和釋放，進一步提高和維持神經敏感性和炎癥狀態[16]。

本實驗的研究結果發現在大鼠偏頭痛發作時，三叉神經節中A2AR的蛋白表達量和CGRP的含量均升高，提示A2AR和CGRP兩者之間量的變化趨勢一致。大量的研究證實在海馬CAl區使用CGRP刺激興奮性突觸后電位并未發生變化,而當應用A2AR激動劑后，發現興奮性突觸后電位較前明顯升高,而此時再加入A2AR抑制劑后，興奮性突觸后電位被明顯抑制[17,18]。阻斷A2AR或者利用腺苷水解酶清除細胞外腺苷都將會阻斷CGRP對神經突觸的興奮性傳遞作用[19,20]。說明A2AR可能促進大腦血管周圍三叉神經CGRP的釋放及增強CGRP的神經突觸傳遞作用,共同導致偏頭痛的發作。

4 結論

本文資料提示,兩組大鼠三叉神經組織無解剖結構上的改變，大鼠行為學改變與三叉神經功能異常有關。表現為A2AR的激活或蛋白上調，CGRP大量釋放，A2AR和CGRP兩者之間量的變化趨勢一致。A2AR、CGRP可能在偏頭痛的發作中發揮重要作用。

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