兒童腸球菌耐萬古霉素表型和耐藥基因檢測分型的研究*

張彩虹 張學忠

(淄博市中心醫院，山東 淄博 255036)

腸球菌已成為導致醫院感染的重要病原菌，隨著抗菌藥物選擇壓力的不斷提高，目前腸球菌獲得耐藥性明顯增強，且呈多重耐藥，耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE)所致的醫院感染呈逐年上升趨勢[1-3]。近些年兒童腸球菌導致敗血癥的發病率增加了6倍[2]。目前兒童感染VRE的臨床治療相當棘手，可用于治療VRE感染的抗菌藥物非常有限，包括價格昂貴的利奈唑胺、達托霉素及毒副作用較大的氯霉素[4-5]。本研究共采集患兒170個肛門拭子進行腸球菌培養及鑒定，篩選出VRE菌株并進行表型及基因型檢測，對VRE定植菌菌種構成、耐藥基因型及表型進行檢測分析，探討是否存在新的耐藥基因簇，為兒童VRE醫院感染防控提供初步實驗研究依據。

1 材料與方法

1.1 臨床實驗菌株 2016年1月～12月期間，每月1次于我院兒科采集10～20位住院患兒肛門拭子，分離經耐萬古霉素腸球菌篩選鑒定培養基培養陽性，革蘭染色符合腸球菌形態的細菌。質控菌株：由衛生部臨床檢驗中心提供， 糞腸球菌ATCC29212。儀器設備采用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統，PCR儀 Deltier Thermal Gradient Cycler PTC-200抗菌藥物粉劑為慶大霉素、氨芐西林、米諾環素、環丙沙星、利奈唑胺由中國藥品生物制品檢定所提供，萬古霉素、青霉素、替考拉寧購自國藥集團藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏實驗 采用瓊脂對倍稀釋法測定萬古霉素、替考拉寧、青霉素、慶大霉素、氨芐西林、米諾環素、環丙沙星、利奈唑胺對21株耐萬古霉素腸球菌的最低抑菌濃度。MIC值為抑制細菌生長的最低藥物稀釋度。抗菌藥物結果解釋和判讀均按2015版美國國家臨床實驗室標準化協會(CLSI)的標準執行[6]，根據所測得的MIC值判讀細菌藥敏結果為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)，見表1。

1.2.2 PCR引物 vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、E. faecalis、E. faecium、rrs (16S rRNA)引物參照文獻設計[7]，由廣州華大基因生物技術有限公司合成，見表2。

表1 抗菌藥物對腸球菌的MIC結果判讀標準Table 1 Criteria for judging MIC results of enterococci by antibiotics

表2 用于擴增van基因的引物Table 2 Primers for amplification of van gene

1.2.3 PCR法確認菌種 反應體系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl雙蒸水，1.0μl引物1-F，1.0μl引物1-R，1.0μlDNA模板。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重復30個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳成像和測序。

1.2.4 PCR法檢測耐藥基因型 反應體系：12.5μl的2xEasyTaq SuperMix，9.5μl雙蒸水，1.0μl引物2-F，1.0μl引物2-R，1.0μlDNA模板。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 延伸1min，重復30個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳成像和測序。

2 結果

2.1 基本情況 本研究中納入170例兒童肛門拭子中篩選出21株VRE，其陽性率12.4%。在分離的21株VRE中屎腸球菌最常見為14株(66.7%)，糞腸球菌為4株，鶉雞腸球菌1株，鉛黃腸球菌1株和不明菌株1株。

2.2 分離的21株VRE對8種抗生素MIC的測定 本研究中VRE對大部分納入測定的抗菌藥物的耐藥率超過50%，包括對環丙沙星的耐藥率為90.5%，對青霉素者為81%，對氨芐西林者為76.2%，對慶大霉素高度耐藥(High level aminoglycosides resistance, HLAR)為61.9%。而對米諾環素敏感率為95.2%，對利奈唑胺的敏感率為100%，見表3。

表3 8種抗菌藥物對21株VRE的MIC值(mg/L)Table 3 MIC value of 8 antibiotics against 21 strains of VRE

2.3 分離的21株VRE對糖肽類抗菌藥物耐藥情況測定 本研究分離的21株VRE均對糖肽類抗菌藥物耐藥，見表4、表5。

表4 萬古霉素對21株耐VRE的MIC值(mg/L)分布Table 4 MIC value distribution of vancomycin against 21 VRE resistant strains

表5 替考拉寧對21株耐VRE的MIC值(mg/L)Table 5 Teicoplanin against 21 strains of VRE resistant MIC value

2.4 耐藥基因的PCR檢測及測序

2.4.1 經PCR檢測21株耐萬古霉素腸球菌耐藥基因型，18株含vanA型耐藥基因，1株含vanC1型耐藥基因，1株vanC2/3型耐藥基因，1株耐藥基因不明確。vanA基因型是本研究中VRE最常見的耐藥基因型。以陰性對照，行PCR，分別選取1株vanA， vanC1、vanC2基因產物電泳成像，見圖1。

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳耐萬古霉素腸球菌PCR產物結果

Figure12%agarosegelelectrophoresisresultsofvancomycinresistantEnterococcusPCRproducts

注：M.molecular size marker(1kb ladder) Lanes； 1.陰性對照; 2.vanA基因陽性對照; 3.vanA基因; 4. vanC1基因;5.vanC2/C3基因; 6.屎腸球菌；7.糞腸球菌

2.4.2 將PCR擴增獲得的耐藥基因片段進行測序(含vanA、vanC1 、vanC2/C3基因菌株各1株), 所得結果與GenBank 上已知序列進行比較, 發現vanA、vanC1 、vanC2/C3基因均未發生突變，見圖2。

2.5 追蹤VRE定植陽性者 追蹤分析VRE定植陽性患者，根據臨床醫生診斷及有感染癥狀患者的痰培養、血培養、尿培養等檢查，21例VRE定植患者沒有繼發VRE感染。

3 討論

研究已證實VRE對大部分抗菌藥物耐藥[3,5]。VanA與VanB是耐萬古霉素腸球菌6個表型中最常見的表型[8-10]。VanA 表型呈萬古霉素和替考拉寧均高水平耐藥，VanB 表型呈萬古霉素高水平耐藥, 替考拉寧低水平耐藥，VanC 表型呈萬古霉素和替考拉寧均低水平耐藥，天然耐藥[11]。VRE基因型與表型可不一致，據報道，有VanB表型-vanA基因型,VanD 表型-vanA基因型，VanB表型-vanC1+vanB基因型等[12-14]。VRE常常顯示多重耐藥(如屎腸球菌通常耐氨基糖苷類和青霉素類)，鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌對萬古霉素呈低水平耐藥。屎腸球菌大多對萬古霉素呈高度耐藥，而糞腸球菌較少見。

圖2耐藥基因測序
Figure2Resistancegenesequencing

注：a. vanA(89)-FOR；b. vanA(89)-REW；c. vanC1(116)-FOR；d. vanC1(116)-EWR；e. VanC2/3(53)-FOR；f. VanC2/C3(53)-REW

文獻報道[15]，韓國醫院15%VRE為VanD表型-vanA基因型，即含vanA基因，卻對替考拉寧敏感或中介。通過體內外一系列實驗證明，替考拉寧治療VanD-vanA的VRE菌株感染將會失敗。研究提示，盡管VanD-vanA的VRE菌株對替考拉寧敏感，但體內外實驗證明替考拉寧對治療VanD-vanA 型VRE菌株感染無效。通過體外藥敏檢測VRE菌的表型，不能作為臨床治療中選擇抗菌藥物唯一的依據，因此在治療耐萬古霉素腸球菌時耐藥基因型測定更有參考價值。

糞便、肛門拭子是篩查分離VRE的最常用標本[16]。本研究所取170個肛門拭子中，耐萬古霉素腸球菌分離陽性率12.4%(21/170)。耐萬古霉素運動腸球菌(鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌)陽性1.2%(2/170)，1株腸球菌不明菌種。21株耐萬古霉素腸球菌中菌種分布情況：屎腸球菌66.7%(14/21)，糞腸球菌19%(4/21)，鉛黃腸球菌4.8%(1/21), 鶉雞腸球菌4.8%(1/21)，不明菌種4.8%(1/21)。耐萬古霉素腸球菌在屎腸球菌中最常見，與多篇文獻報道一致。

本研究中，VRE對大部分檢測抗菌藥物耐藥率超過50%，包括環丙沙星(90.5%)、青霉素(81%)、 氨芐西林(76.2%)、慶大霉素(HLAR 61.9%)。但仍對米諾環素(95.2%)與利奈唑胺 (100%)敏感。21株VRE的萬古霉素、替考拉寧MIC范圍分別為8μg/mL->512μg/mL、 0.25μg/mL->512μg/mL ，對萬古霉素高水平耐藥的VRE(MIC，64μg/mL-≥1000μg/mL)18 株，對替考拉寧高水平耐藥的VRE(MIC，16-512 μg/mL)14 株。對萬古霉素與替考拉寧菌高水平耐藥的VRE株14株，萬古霉素高水平耐藥但對替考拉寧敏感(MIC≤8μg/mL)的VRE 4 株。本研究中，鉛黃腸球菌對萬古霉素高水平耐藥，但對替考拉寧敏感; 鶉雞腸球菌對萬古霉素為中介，但對替考拉寧敏感。

經PCR檢測，21株耐萬古霉素腸球菌，18株含vanA型耐藥基因，1株含vanC1型耐藥基因，1株vanC2/C3型耐藥基因，1株耐藥基因不明確。無vanB型耐藥基因。根據PCR結果與藥敏結果分析，9株vanA基因型與表型相符，2株vanA基因簇表型為萬古霉素中介，替考拉寧敏感，7株VanD 表型-vanA基因型；鉛黃腸球菌對萬古霉素高水平耐藥(MIC=512mg/L)，但對替考拉寧敏感(MIC=4mg/L)，與VanC表型不符; 鶉雞腸球菌對萬古霉素為中介( MIC=8mg/L )，但對替考拉寧(MIC=0.25mg/L)敏感，與VanC表型相符。

本研究中，1株不明菌種且不明耐藥基因型，由于本研究中PCR引物只有屎腸球菌、糞腸球菌及vanC1、vanC2、vanC3對應特異性菌株，耐藥基因型引物僅有vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3,需進一步測定該菌株16S rRNA及其他6種耐藥基因型是否相符,如不相符還應對耐藥型進行進一步明確，該菌株表型呈VanA表型。進行了體外藥敏實驗及PCR檢測耐藥基因型，僅判斷出VRE的表型及基因型， VanD表型-vanA基因型VRE感染是否能使用替考拉寧治療，仍需要進行體內外實驗加以證明。

追蹤VRE定植陽性患者，無VRE感染。我院萬古霉素的使用合理，手衛生規范，適當隔離與VRE陽性患者密切接觸者。因此雖然肛門拭子VRE陽性率12.4%，但VRE定植陽性患者，VRE感染率為0，尚沒有出現VRE。國內許多研究報道多家醫院已出現了成人VRE，且對VRE同源性及流行性進行了分析報道[9,17，18]。近些年，隨著萬古霉素的大量應用，VRE的不斷出現，兒童中也將會出現VRE[20，21]，因此對腸球菌的耐藥監測是勢在必行的。

4 結論

本文資料顯示，VRE對利奈唑胺、米諾環素較敏感，臨床可作為治療兒童VRE感染的選擇藥物。本研究中VanA基因型最常見,臨床在使用抗菌藥物治療中應予重視。

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