胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1表達對鼻咽癌細胞系CNE1發生發展的研究

鄭富春,祁曉倩

(陜西省安康市人民醫院：1.耳鼻咽喉科；2.檢驗科 725000)

鼻咽癌是耳鼻咽喉科較為常見的癌癥之一，發病因素可能與當地濕熱的環境氣候及飲食偏辛辣有關[1]。鼻咽癌病死率較高，目前臨床多采用放射治療，原發性鼻咽癌在提高患者生存率等方面取得了顯著成效，但手術時間較長，預后不佳且易造成患者面容改變[2]。通過抑制胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(IGFBP-rP1)的表達對鼻咽癌細胞系CNE1細胞的增殖、侵襲、遷移能力的影響，檢測CNE1細胞半衰期變化情況和相關蛋白變異后性質的表達[3]。現探討在此蛋白基礎上構建2條特異性針對IGFBP-rP1基因的小干擾RNA(siRNA32、siRNA34)，并采用各種臨床檢測技術對IGFBP-rP1基因和CNE1細胞的相關指標進行檢測,分析抑制IGFBP-rP1基因的表達能有效治療鼻咽癌且術后患者不易發生并發癥。報道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 本研究所用CNE1細胞購買自中南大學高等研究中心細胞實驗室，轉染質粒購買自上海吉瑪公司。

1.2儀器與試劑 (1)材料：鼻咽癌細胞系CNE1細胞，空白載體，2條特異性針對IGFBP-rP1基因的小干擾RNA(siRNA32、siRNA34)，轉錄酶和逆轉錄酶。(2)試劑：Trizol試劑，秋水仙素，龍膽紫溶液，無酶RNA沖洗液，SYBR Green 1染料，上游引物，下游引物，dNTP。(3)RT-PCR、Western blot檢測試劑：30 g丙烯酰胺和0.8 g N,N′-亞甲丙烯酰胺、4×Tris·Cl/SDS,pH 8.8、4×SDS電泳緩沖液，TEMED (N,N,N′，N′-四甲基乙二胺),10%過硫酸銨。(4)四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑：MTT 0.5 g，100 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)或無酚紅培養基。(5)腫瘤細胞重組基底膜侵襲實驗試劑：無血清DMEM，1%胎牛血清DMEM,1640完全培養基(也可加到20%血清)，無菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或甲醇，結晶紫染液[0.1%(g/mL)PBS結晶紫]。(6)細胞運動實驗：等滲鹽水,細胞運動導板。(7)流式細胞儀技術實驗試劑：秋水仙素。

1.3siRNA設計與構建 將IGFBP-rP1基因的DNA雙螺旋結構通過解螺旋酶進行催化裂解打開成單鏈后，對其中之一的單鏈進行逆轉錄獲得RNA，將此RNA進行PCR擴增后得到多條單鏈RNA，向這些多條RNA中加入rRNA進行蛋白質翻譯后，再利用mRNA進行核糖體加成，然后形成siRNA[4]。

1.4細胞培養及轉染 將CNE1細胞置入瓊脂培養基中放入細胞保溫箱進行傳代培養，將培養后的細胞隨機分為4組即陰性對照組、空白組、siRNA32組(siRNA32轉染)、siRNA32組(siRNA34轉染)。其中空白組不做任何處理；陰性對照siRNA轉染；siRNA32組與siRNA32組分別轉染siRNA32轉染和siRNA34轉染。分別采用RT-PCR、Western blot檢測各組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白的表達水平，使用細胞運動實驗檢測CNE1細胞的遷移能力，應用腫瘤細胞重組基底膜侵襲實驗檢測CNE1細胞的侵襲能力、MTT法檢測CNE1細胞的增殖能力、流式細胞儀技術檢測細胞周期。8～10周期后分別對4組實驗結果進行統計，分析數據結果。

1.5檢測方法

1.5.1RT-PCR檢測方法 4組細胞分別進行RT-PCR法檢測，取凍存CNE1細胞，5 000 r/min離心40 min后放入無酶RNA，應用無酶RNA對各組細胞進行加速繁殖后，只去除較多的傳代培養的各組細胞進行觀察。

1.5.2蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測方法 4組細胞分別進行Western blot法檢測，將培養的CNE1細胞放在2塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，配制好的甲基丙烯酸酯分離膠液體并脫氣，然后放入13%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌，混勻。按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的甲基丙烯百分比濃度，以上2種材料進行充分混合后將分離的CNE1細胞與混合液一起37 ℃溫水中孵育40 min，充分清洗，再將硝酸纖維素膜與CNE1細胞混合顯色。

1.5.3細胞運動實驗 4組細胞分別進行細胞運動實驗，取凍存CNE1細胞，12 000 r/min離心30 min后應用等滲鹽水制作等滲液細胞運動導板，CNE1細胞懸液滴在導板的同一高度，觀察各組細胞的運動情況[5]。

1.5.4腫瘤細胞重組基底膜侵襲實驗 4組細胞分別進行腫瘤細胞重組基底膜侵襲實驗，取凍存CNE1細胞10 000 r/min離心40 min，應用基質膠鋪板制備CNE1細胞懸液，檢測各組細胞侵襲情況[6]。

1.5.5MTT法 4組細胞分別進行MTT法檢測，取凍存CNE1細胞15 000 r/min離心40 min，每0.2 mL Trizol試劑裂解樣本中加入0.15 mL氯仿進行裂解操作，26 ℃水浴加熱采用無酶RNA沖洗液進行洗滌，再次15 000 r/min離心10 min，獲得RNA，將此RNA進行逆轉錄后培養，檢測各組細胞增殖情況[7]。

1.5.6流式細胞儀技術 4組細胞分別進行流式細胞儀技術實驗，取凍存CNE1細胞5 000 r/min離心45 min，向各組細胞中加入秋水仙素溶液，使細胞增殖的速度減緩從而使細胞固定在特定的細胞周期上，檢測各組細胞的細胞周期。

2 結 果

2.1各組細胞IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達水平結果比較 陰性對照組和空白組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達水平顯著低于陰性對照組和空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各組IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表達水平結果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

注：1表示空白組；2表示陰性對照組；3表示siRNA34組；4表示siRNA32組

圖1 Western blot法檢測各組IGFBP-rP1蛋白表達水平

2.2各組細胞CNE1細胞遷移能力結果比較 陰性對照組和空白組CNE1細胞遷移數目比較，差異無統計學意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組CNE1細胞遷移數目顯著低于陰性對照組和空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞CNE1細胞遷移能力結果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

2.3各組細胞CNE1細胞侵襲能力結果比較 陰性對照組和空白組穿過PVP-F膜的CNE1細胞數目比較，差異無統計學意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組穿過PVP-F膜的CNE1細胞數目顯著低于陰性對照組和空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞CNE1細胞侵襲能力結果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

2.4各組細胞CNE1細胞增殖能力結果比較 培養24、48 h后，陰性對照組和空白組CNE1細胞增殖OD值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；siRNA32組和siRNA34組CNE1細胞增殖OD值顯著低于陰性對照組和空白組(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞CNE1細胞增殖能力OD值結果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

2.5各組細胞CNE1細胞增殖周期結果比較 培養48 h后，siRNA32組和siRNA34組G0/G1期、G2/M期細胞所占比例顯著高于陰性對照組和空白組(P<0.05)；siRNA32組和siRNA34組S期細胞所占比例顯著低于陰性對照組和空白組(P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞CNE1細胞增殖周期結果比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，bP<0.05

3 討 論

鼻咽癌病理病因目前認為與3種因素有關，即遺傳因素、病毒因素(主要為EB病毒感染)、環境因素，臨床對鼻咽癌的治療方法很多，但治療效果都不確切，現抑制鼻咽癌相關基因的表達對鼻咽癌進行靶向治療[8]。

IGFBP-rP1是一種近年來被發現的胰島素樣生長因子泛素偶聯蛋白，該蛋白翻譯攜帶的鼻咽癌基因的獨特高表達性與鼻咽癌的發生、發展密切關相[9]。IGFBP-rP1通過CNE1細胞上皮間充質胚胎轉化后在鼻咽癌疾病進程中起癌基因作用，IGFBP-rP1能通過促鼻咽癌原癌基因表達而促進鼻咽癌細胞的增殖、轉移、侵襲[10-11]。本研究結果證實，IGFBP-rP1對鼻咽癌細胞的干細胞特性具有調控作用，且證明IGFBP-rP1能經特異性siRNA載體而調控鼻咽癌相關基因的表達，實現其增強鼻咽癌干細胞特性的作用。本研究結果顯示，可以通過抑制IGFBP-rP1表達而抑制鼻咽癌CNE1細胞的增殖、侵襲、轉移。IGFBP-rP1培養數天后細胞遷移能力較強，說明IGFBP-rP1表達后有較多CNE1細胞進行遷移，提示鼻咽癌在該基因的調控下可發生較快遷移至其他組織器官，甚至會累及到較多的淋巴細胞。

CNE1細胞RNA中的琥珀酸還原酶，能使外源性MTT氧化還原為不溶性的甲瓚并沉積細胞，但死細胞無此功能[12]。當細胞增殖時并不影響甲瓚在CNE1細胞中的數量，會隨著細胞增殖而分裂增多，伴隨細胞質中不斷裂解為更小的粒子，當CNE1細胞增殖趨向最大化完成時，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在700 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活CNE1細胞增殖的數量[13-15]。本研究結果顯示，IGFBP-rP1相對表達量均值較低，說明表達基因產物與鼻咽癌的特異性較高。而IGFBP-rP1增殖較多CNE1細胞，說明該蛋白表達后鼻咽癌相關細胞會出現高增殖效率。不同細胞周期進行抑制IGFBP-rP1時所產增殖的細胞數量、遷移、侵襲性不同，表明在特定時期對該蛋白進行抑制能有效治療鼻咽癌。

本研究創新性在于通過抑制IGFBP-rP1基因表達對鼻咽癌系細胞進行靶向定位治療，可避免臨床其他手術治療的不確定性。該手術利用基因抑制法可增強患者預后，鼻咽癌系細胞增殖率、轉移率、侵襲周圍其他組織的概率極大地降低，值得臨床其他難治性手術的借鑒。

綜上所述，探討抑制IGFBP-rP1可有效抑制鼻咽癌細胞系CNE1細胞的增殖、侵襲、遷移能力，安全可靠，值得臨床推廣使用。

參考文獻

[1]黃國森，胡學鋒．鼻咽癌顱底骨質破壞放療后的修復[J]．中國現代醫學雜志，2015，25(4)：102-106．

[2]陳宇翰，李先明．以乏氧誘導因子-1α及其信號通路為鼻咽癌治療靶點的相關研究進展[J]．廣東醫學，2015，36(15)：2436-2438．

[3]劉炎霖，陳鈺輝，劉富中，等．水茄泛素結合酶E2基因StUBCc的克隆及黃萎病菌誘導表達分析[J]．園藝學報，2015，42(6)：1185-1194．

[4]陳學昭，張雷，于珊珊，等．松江鱸(Trachidermus fasciatus)泛素結合酶E2-D2基因的分子克隆及組織表達分析[J]．海洋學報(中文版)，2015，37(10)：133-140．

[5]楊麗樺，何融泉，張昌文，等．表皮生長因子受體靶向治療鼻咽癌的研究進展[J]．廣東醫學，2015，36(18)：2929-2931．

[6]CHAUGULE V K,WALDEN H.Specificity and disease in the ubiquitin system[J].Biochem Soc Trans,2016,44(1):212-227.

[7]MILES J A,FROST M G,CARROLL E,et al.The fanconi anemia DNA repair pathway is regulated by an interaction between ubiquitin and the E2-like fold domain of FANCL[J].J Biol Chem,2015,290(34):20995-21006.

[8]HIRA A,YOSHIDA K,SATO K,et al.Mutations in the gene encoding the E2 conjugating enzyme UBE2T cause Fanconi anemia[J].Am J Hum Genet,2015,96(6):1001-1007.

[9]賈招閃，申紅妙，李正楠，等．基于MTT染色法對葡萄生單軸霉孢子囊存活力的檢測[J]．菌物學報，2016，35(8)：939-945．

[10]周權明，楊小朋，錢章林，等．機械吹打法、胰酶消化法分離新生大鼠腦組織神經干細胞效果觀察[J]．山東醫藥，2016，56(20)：18-20．

[11]李紅梅，李靜，靳偉，等．新木脂素的酶法糖基化及抗腫瘤活性[J]．南方醫科大學學報，2015，35(11)：1570-1574．

[12]林少雄,張永,魯娟,等.干擾內皮素-1可抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲[J].南方醫科大學學報,2016,36(7):915-920.

[13]孫仕晨，董騰哲，黃昕，等．Transwell共培養條件下誘導脂肪干細胞成骨能力的改變[J]．中國組織工程研究，2016，20(28)：4155-4161．

[14]紀曉方，李麗英，常娜．高內涵分析及Western blotting法在蛋白質核質分布研究中的應用及比較研究[J]．首都醫科大學學報，2016，37(5)：616-620．

[15]唐廣義，韓濤，殷東風，等．益氣健脾抗癌法對結腸癌組織PKC及亞型PKCδ、PKCε蛋白表達的影響[J]．中國腫瘤生物治療雜志，2016，23(3)：366-370．