特應性皮炎患者外周血濾泡性輔助性T細胞的特征

劉 芳，陳 端

(1.湖北省黃石市結核病防治院 435000；2.湖北省黃石市臨床檢驗中心 435000)

特應性皮炎(AD)是一種常見的慢性炎性疾病，與遺傳過敏體質有關，以皮膚干燥、脫屑、瘙癢為主要表現，易診難治，反復發作，嚴重影響患者的生活質量。該病病因復雜，發病機制尚不清楚。目前認為AD的發生與免疫調節紊亂密切相關，其中CD4+T淋巴細胞在其發病機制中備受關注。有研究報道AD患者皮損中浸潤的大量炎性細胞主要為CD4+T淋巴細胞[1]。濾泡性輔助性T(Tfh)細胞是一種新型CD4+T淋巴細胞亞群，與其他T淋巴細胞亞群功能不同，主要為促進和誘導B細胞的成熟和分化[2]。該細胞具有其獨特的免疫表型，可高表達CXC趨化因子受體5(CXCR5)、誘導性共刺激分子(ICOS)、程序性死亡受體-1(PD-1)、B細胞淋巴瘤-6(Bcl-6)、白細胞介素-21(IL-21)，其中ICOS、PD-1的表達對Tfh細胞的功能具有重要的作用[3]。但Tfh細胞在AD患者中的特征及意義尚不清楚。現探討AD患者外周血Tfh細胞的表達特征，為闡明AD的發病機制提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 20例AD患者全部來自2015年6月至2016年7月該院門診的就診患者(AD組)，符合Williams診斷標準，男12例，女8例，年齡12～31歲，平均年齡(20.13±5.01)歲；病程11～30年，平均病程(17.46±7.78)年。所有患者入組前1個月內未系統使用糖皮質激素及免疫抑制劑治療，近1周內未口服抗組胺藥及外用糖皮質激素，均未合并腫瘤及其他嚴重的系統性疾病。采用歐洲特應性皮炎評分系統(SCORAD)評估病情嚴重程度。進行為期1個月隨訪，隨訪期間所有患者均采用中藥湯劑口服和他克莫司軟膏外用治療。健康對照者(健康對照組)為12例健康志愿者，男7例，女5例，年齡14～30歲，平均年齡(22.52±4.75)歲。2組研究對象的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 小鼠抗人CD4-Percp抗體、小鼠抗人CXCR5-FITC抗體、小鼠抗人ICOS-PE抗體、小鼠抗人PD-1-APC抗體，FACSCalibura流式細胞儀、溶血素均購自美國BD公司。

1.3方法 2組研究對象治療前和治療1個月后均于清晨空腹采取外周靜脈血3 mL，肝素鋰抗凝。取全血200 μL依次加入抗體：Percp-anti-CD4 6 μL，FITC-anti-CXCR5 4 μL，APC-anti-PD-1 5 μL，PE-anti-ICOS 5 μL，4 ℃避光孵育30 min，然后加入溶血素2 mL，震蕩混勻，室溫避光5 min，離心去上清液后再加入2 mL PBS洗滌1次，最后加入150 μL 4%多聚甲醛固定，4 ℃保存。標本于24 h內完成檢測。

2 結 果

2.1AD組患者外周血Tfh細胞特征 AD組患者外周血Tfh細胞頻率明顯高于健康對照組[(10.29±1.87)%vs. (14.01±2.73)%,P<0.01)]。與健康對照組比較，AD組患者外周血Tfh細胞表面PD-1和ICOS的表達也明顯升高[(0.45±0.16)%vs. (0.64±0.17)%,P<0.05；(0.33±0.08)%vs. (0.45±0.11)%,P<0.01]。見圖1。

注：A表示外周血Tfh細胞頻率；B表示外周血Tfh細胞表面PD-1表達；C表示Tfh細胞表面ICOS表達

圖1 AD組患者外周血Tfh細胞特征

2.2AD組患者Tfh細胞與疾病嚴重程度的相關性 AD組患者外周血Tfh細胞頻率與SCORAD評分呈明顯的正相關關系(r=0.54，P=0.01);Tfh細胞表面PD-1和ICOS表達水平與SCORAD評分具有正相關趨勢，但差異無統計學意義(r=0.43，P=0.06；r=0.27，P=0.25)。見圖2。

注：A表示外周血Tfh細胞頻率與SCORAD評分呈正相關關系；B表示PD-1表達水平與SCORAD評分具有正相關趨勢；C表示ICOS表達水平與SCORAD評分具有正相關趨勢

圖2 AD組患者Tfh細胞與疾病嚴重程度的相關性

2.3AD組患者治療前后Tfh細胞頻率及功能的變化 AD組患者采用中藥湯劑口服和他克莫司軟膏外用治療，時間為1個月。治療后皮疹及瘙癢減輕，且外周血Tfh細胞頻率較治療前明顯降低[(14.01±2.73)%vs. (11.61±2.98)%,P<0.05]。與治療前比較，AD患者外周血Tfh細胞PD-1和ICOS表達也明顯降低[(0.63±0.17)%vs. (0.51±0.21)%,P<0.05；(0.45±0.11)%vs. (0.38±0.15)%,P<0.05]。見圖3。

注：A表示外周血Tfh細胞頻率較治療前降低；B表示外周血Tfh細胞PD-1表達降低；C表示外周血Tfh細胞ICOS表達降低

圖3 AD組患者治療前后Tfh細胞頻率及功能的變化

3 討 論

AD是一種常見的慢性瘙癢性皮膚病，在發展中國家約為10%～20%兒童患有AD，是最常見的皮膚病。AD發病機制復雜，目前認為該病是由環境和基因等多種因素相互作用，導致機體免疫功能紊亂和皮膚屏障受損而引起的變態反應性皮膚病。既往研究表明，AD患者皮損中Th2細胞及其相關細胞因子均明顯升高，因此認為AD主要是由Th2細胞介導的炎性疾病[4]。隨著新型CD4+T細胞亞群的不斷出現及對AD免疫發病機制研究的不斷深入，近期研究報道Th17、Th22、調節性T細胞等細胞亞群在AD的發病機制中均具有重要作用[5-7]。Tfh細胞是一種新型CD4+T細胞亞群，起重要的免疫作用，參與多種免疫相關性疾病的發生、發展。

Tfh細胞最初發現于淋巴生發中心，主要功能為促進生發中心的成熟、誘導B細胞分化及促進抗體的產生[2]。近年來研究發現，外周血同樣存在Tfh細胞，其與存在于生發中心的Tfh細胞具有相似的免疫表型及功能[8]。目前常用CXCR5+ CD4+T細胞定義外周血Tfh細胞。許多研究顯示，多種免疫相關性疾病中存在Tfh細胞含量的改變和功能的紊亂，如Henoch-Schnlein紫癜、類風濕關節炎、強直性脊柱炎等[9-11]。本研究結果表明，AD組患者外周血Tfh細胞頻率較健康對照組顯著升高，提示Tfh細胞在AD的發病機制中起一定的作用。Tfh細胞表面分子ICOS的表達對Tfh細胞產生重要作用，可調節Tfh細胞的分化和功能[12]。PD-1是Tfh細胞另一個重要的表面分子，對Tfh細胞的活化具有重要的作用[13]。本研究結果顯示，AD組患者Tfh細胞表面PD-1、ICOS表達水平明顯升高，說明AD患者Tfh細胞不僅含量升高功能也處于活化狀態。本研究結果顯示，Tfh細胞頻率與SCORAD評分呈明顯的正相關關系，而Tfh細胞表面PD-1和ICOS表達水平與SCORAD評分具有正相關趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，可能與患者標本數較少有關，因此需大樣本量進一步驗證Tfh細胞表面PD-1和ICOS的表達水平與SCORAD評分的相關性。治療1個月后，AD患者皮疹好轉，瘙癢減輕，外周血Tfh細胞頻率降低，且功能性分子PD-1、ICOS表達水平也顯著降低，說明Tfh細胞可能與疾病嚴重程度密切相關。

綜上所述，AD患者Tfh細胞不僅頻率升高且功能處于活化狀態，治療后疾病減輕，外周血Tfh細胞頻率也降低，功能性分子PD-1、ICOS的表達水平也降低。本研究結果提示Tfh細胞在AD發病機制中可能具有重要作用，為闡明AD發病機制提供新的思路，為治療AD提供新型的生物靶點。

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