三亞地區神經癥狀患者萊姆病血清篩查分析*

李 沙，陳 婷，李 歡，俞書義，陳 海，朱 雄

(海南省三亞市人民醫院檢驗科 572000)

萊姆病是一種由蜱叮咬傳播的人獸共患病，其致病病原體為伯氏疏螺旋體。病原體進入機體后早期表現為皮膚游走性紅斑、流感樣癥狀、關節痛、肌肉痛、胸痛等癥狀，晚期可表現為面神經炎、腦膜炎、面神經麻痹、肢體麻木等神經系統受損[1-2]。萊姆病已在全球70多個國家報道，分布廣泛。我國萊姆病主要集中在東北林區，但南方許多省份也有報道。有學者已證實海南存在萊姆病病原體感染[3]。三亞作為海南省國際旅游島的中心城市，人口聚集日益上升。海南省大部分1級或2級醫院臨床醫師對萊姆病不了解甚至不知道。現探討三亞地區萊姆病感染情況，為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年3―8月該院因神經系統癥狀就診患者的外周靜脈血5 mL，分別編號和登記，離心分離血清置―20 ℃低溫冰箱保存待檢。

1.2儀器與試劑 羊抗人免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)熒光抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgM和SPA，均購自美國Sigma公司。PD91菌免疫兔血清、萊姆病抗原片和蛋白免疫印跡法(Western blot)膜條由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所萊姆病室提供。

1.3萊姆病抗體檢測

1.3.1間接免疫熒光試驗(IFA) 采用PD91菌株常規制備抗原片，將血清用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mmol/L，pH 7.2)從1∶16開始倍比稀釋。在熒光顯微鏡40×10視野下，50%以上螺旋體染上明亮熒光，抗體效價達到IgM≥1∶64或IgG≥1∶128者為陽性。同時做陰性和陽性對照。陰性對照為PBS，陽性對照為PD91菌免疫兔血清。

1.3.2Western blot 將IFA法初篩的陽性標本，進一步使用Western blot檢測。應用PBS-T以1∶25稀釋血清并浸泡抗原條，震蕩4 h，洗脫5次，每次至少10 min，將抗原條分別加入2抗IgG或IgM，過夜。再經過洗脫5次，每次至少10 min，加入顯色劑顯色30 min。顯色結束用純水終止反應。陰性對照為PBS-T，陽性對照為PD91菌免疫兔血清。Western blot結果根據《中國萊姆病WB診斷標準》進行判定。

2 結 果

2.1IFA法檢測實驗結果 采用IFA方法對251例神經系統癥狀患者的血清萊姆病抗體進行檢測，熒光顯微高倍鏡下50%視野顯示明亮菌體熒光為陽性，其中IgG抗體陽性31例，IgM抗體陽性14例，IgG和IgM抗體同時陽性3例，陽性率16.73%。見圖1和表1。

注：箭頭所指為高倍鏡視野下PD91伯氏疏螺旋體顯示綠色熒光，50%視野顯示菌體熒光為陽性

圖1 IFA法檢測血清萊姆病抗體菌陽性(40×10)

2.2Western blot復檢實驗結果 251例患者通過IFA法檢出陽性42例，對42例陽性標本進行Western blot復檢，結果顯示IgG抗體陽性7例，IgM抗體陽性5例，IgG和IgM抗體同時陽性2例，感染率為3.98%。見表2。

表1 251例神經癥狀患者血清萊姆病IFA實驗結果

表2 42例IFA陽性患者的Western blot復檢結果

2.3251例患者的神經系統臨床表現 Western blot復檢10例萊姆病患者中，面神經炎1例，面神經麻痹2例，腦實質損害5例，肢體麻木2例等感覺異常表現。見表3。

表3 251例神經系統癥狀患者不同的臨床表現

3 討 論

萊姆病是由伯氏疏螺旋體引起的一種蜱媒螺旋體病，傳播媒介主要是幾種近緣硬蜱，通過蜱叮咬將病原體傳播人群而發病[4-5]。該病是一種多系統受損的綜合征，除表現皮膚慢性游走紅斑，心臟受損，關節癥狀外，還可出現復雜的神經系統癥狀[6]。神經系統損害是萊姆病最嚴重的臨床表現之一，伯氏疏螺旋體具有高度的嗜神經性，不僅可引起神經系統癥狀，還可長期潛伏中樞神經系統，在不同階段表現出不同的神經螺旋體病，嚴重影響患者的生活質量。調查神經系統癥狀患者的萊姆病情況，可為臨床提供一個警示和參考。

自1975年發現萊姆病以來，至今世界上已有四大洲、70多個國家有該病報道[7]。我國于1986年首次在黑龍江省海林縣林區發現萊姆病[8]。近年來調查表明，我國存在較廣泛的萊姆病自然疫源地。患病率較高的地方主要集中在東北三省、內蒙古大興安嶺林區、新疆天山、長江中上游山林地區。南方地區如湖南、湖北、福建等地都報道了該病的存在。海南省作為中國最南端的省份，在2011年就有學者報道了蜱感染疾病[9]。2015年也有學者對海南省關節炎和神經癥狀患者進行血清萊姆病伯氏疏螺旋體抗體篩查，采用IFA法篩查，進一步使用Western blot確證，然后對陽性患者血清提取DNA和PCR，產物進行基因測序分析，確證海南省存在萊姆病[3]。本研究調查三亞地區251例神經系統癥狀患者的萊姆病情況，結果顯示IFA法初篩陽性率為16.73%，Western blot確證感染萊姆病10例，感染率3.98%，表明三亞地區存在神經系統癥狀的萊姆病患者，提示臨床對該類患者應考慮是否患萊姆病。

本研究結果表明，IFA法檢測251例血清萊姆病抗體，初篩陽性率為16.93%，而Western blot檢測陽性率為3.98%，IFA法陽性率高于Western blot的原因是，IFA法與鉤端螺旋體、梅毒螺旋體有交叉反應，而Western blot抗原膜片為伯氏疏螺旋體的特異性抗原。有學者通過IFA法和酶聯免疫吸附試驗法分析827例疑似萊姆病患者的血清伯氏疏螺旋體抗體發現，陽性135例，陽性率16.32%，其中神經系統癥狀患者344例，陽性88例，陽性率為25.6%[10]。如果通過Western blot檢測患者血清存在伯氏疏螺旋體抗體，再結合臨床癥狀和蜱叮咬史，基本可以確診患有萊姆病。

本研究認為三亞地區存在萊姆病，可為臨床提供參考。據三亞市國土環境資源局的統計數據顯示，2015年三亞的森林覆蓋率達68%，當地存在大量林區工人和護林人員，林區作業者是萊姆病易感人群，感染源為含有伯氏疏螺旋體的蜱，通過叮咬傳播。本研究下一步目標將根據患者的住所和作業環境溯源，捕捉當地的蜱，進行病原學培養。若能成功培養伯氏疏螺旋體，將成為該地區是萊姆病自然疫源地的直接證據。

參考文獻

[1]孫紅勝，胡乃文．萊姆病的臨床表現[J]．山東醫藥，2012，52(43)：90-91.

[2]CAMERON D J,JOHNSON L B,MALONEY E L.Evidence assessments and guideline recommendations in Lyme disease:the clinical management of known tick bites,erythema migrans rashes and persistent disease[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(9):1103-1135.

[3]朱雄，張琳，侯學霞，等．海南省關節炎和神經系統疾病患者萊姆病調查[J]．中國人獸共患病學報，2015，31(4)：353-356.

[4]SANCHEZ J L.Clinical manifestations and treatment of Lyme disease[J].Clin Lab Med,2015,35(4):765-778.

[5]MEAD P S.Epidemiology of Lyme disease[J].Infect Dis Clin North Am,2015,29(2):187-210.

[6]HALPERIN J J.Nervous system Lyme disease[J].Infect Dis Clin North Am,2015,29(2):241-253.

[7]SHAPIRO E D.Borrelia burgdorferi (Lyme disease)[J].Pediatrics in Review,2014,35(12):500-509.

[8]艾承緒，溫玉欣，張永國．黑龍江省海林縣林區萊姆病的流行病學調查[J]．中國公共衛生，1987，6(2)：82-85．

[9]金玉明，張麗娟，孫蓮英，等．海南省澄邁縣新發斑點熱流行病學調查[J]．疾病監測，2011，26(1)：18-22．

[10]耿震，侯學霞，郝琴，等．827例擬診萊姆病患者抗伯氏疏螺旋體抗體檢查結果分析[J]．中國媒介生物學及控制雜志，2007，18(3)：219-221.