養殖水產品中磺胺類藥物的檢測方法及殘留分析研究進展

余麗梅， 宋 超， 張 聰， 陳家長，

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081； 2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫 214081;3.農業部水產品質量安全環境因子風險評估實驗室，江蘇無錫 214081； 4.農業部長江下游漁業生態環境監測中心，江蘇無錫 214081)

中國是水產養殖大國，據中國統計年鑒報道，2013年我國水產品總產量達6 172萬t，而人工養殖所占比例高達 92.4%[1]。中國是抗菌藥物生產和使用大國[2]。抗菌藥物在水產品養殖過程中主要用于多種細菌性疾病的預防和治療、促進水生動物的生長和發育以及降低某些營養物質的需求量等[3]。但抗菌藥物在使用過程中常常出現亂用和濫用現象[4]，導致污染問題嚴重。養殖廢水中殘留的抗菌藥物可能對水生環境造成污染[5]，破壞水生環境的生態系統平衡性；而水產品是與人類生活息息相關的食物之一，抗菌藥物藥物的不合理使用導致水產品中藥物殘留，能夠直接或者間接地通過環境、食物鏈等對人體產生毒副作用，引起細菌耐藥性的增加、觸發過敏反應等[6]，從而對人類健康構成威脅。

磺胺類抗菌藥物是一種具有基本官能團“對氨基苯磺酞胺”的一類藥物的總稱[7]，也是應用得最多最早的一類人工合成的抗菌藥物[8]。它能夠干擾大多數革蘭氏陽性菌和陰性菌的生長繁殖，對魚類爛鰓病、細菌性豎鱗病、癤瘡、弧菌病、腸炎赤鰭病、鞭毛蟲病等也都有良好的防治效果[9-10]；并且性質穩定、高效、低毒、抗菌譜廣、價格低廉，因此在水產養殖中被廣泛使用，例如作為動物飼料添加劑、促生長劑[11]、預防和治療各種細菌性魚病等，對于降低水產品的發病率、改善水產品品質[9]和提高經濟效益方面均具有顯著效果。

然而，磺胺類抗菌藥物不合理使用可能逐漸成為一種新型的有機污染物，對環境和人體健康都存在潛在的威脅，因此其在養殖水產品中的殘留情況日益受到關注。本研究主要對磺胺類抗菌藥物在水產養殖中的應用情況、檢測方法以及在養殖水產品中的殘留情況作簡要綜述，并指出了一些不足和需要進一步探究的方向，對深入了解磺胺類抗菌藥物在養殖水產品中的殘留情況，及時采取危害防治措施、保護人類健康和生態系統穩定都具有重要意義。

1 水產品中的磺胺類抗菌藥物的來源和危害

1.1 水產品中的磺胺類抗菌藥物的來源

水產品中的磺胺類抗菌藥物主要來源于2個方面：養殖水體和養殖本身的投加。養殖水體是水生生物的集聚場所，具有顆粒懸濁物多、水色深、組成多樣、生物密度高、抗菌藥物組成復雜等特點。水中抗菌藥物的存在直接會引發水產品中的抗菌藥物殘留量蓄積，在給人們健康帶來極大隱患的同時也嚴重阻礙了我國水產品進出口貿易的發展[12]。養殖水體中的抗菌藥物主要來源于以下3個方面：地表水、地下水及應用水等水資源的污染；土壤、底泥等沉積物的抗菌藥物殘留；水產養殖管理者人為的添加。動物糞便中已有多種磺胺類抗菌藥物檢出[13]，而在許多地區，動物糞便作為有機肥料被廣泛施用于田間，造成水體和土壤污染，污染的土壤經雨水淋濾、地表徑流等作用又間接地污染了地表水和地下水，它們之間又通過補給關系造成交叉污染[14]。養殖水體中殘留的抗菌藥物易被底泥吸附，這又進一步加深了養殖水體中抗菌藥物污染的情況。何秀婷等在大亞灣、陽江等6個養殖區的沉積物中均能檢出磺胺類抗菌藥物的殘留，其中磺胺嘧啶的檢出率高達82.7%[15]。以飼料添加劑的形式應用于水產養殖是另一種抗菌藥物直接進入水產品中的方式。早在20世紀70年代，我國平均每年就有約6 000 t的抗菌藥物用作飼料添加劑[16]。抗菌藥物飼料添加劑的作用機理可以概括為：(1)殺滅病原微生物，抑制病原菌增殖，使動物的養分增加，促進動物的順利生長；(2)使動物的腸壁變薄，加強養分的吸收；(3)延長飼料在動物體消化吸收的時間；(4)提高機體的免疫能力，增強對外界環境變化的適應能力；(5)刺激機體的免疫系統，使得機體的各種生理活動加強加速，從而促進機體的生長發育。

1.2 水產品中的磺胺類抗菌藥物的危害

1.2.1 誘導抗藥性細菌的產生 低濃度的抗菌藥物環境會使長期生長于其中的菌類的抗藥性(抗藥性是指生物，尤指病原微生物對抗菌藥物產生的耐受和抵抗能力)增強，進而破壞人、動物和環境三者之間微生物系統的平衡性[14]。菌株的抗藥性變異一經產生，就可以代代相傳，因此攜帶抗藥性基因的菌株可能成為了一種新型污染物；它們還可以感染原來沒有抗藥性的敏感菌，使抗藥菌逐年增加。磺胺類抗菌藥物的濫用已經導致了大量抗藥性菌株的產生，給臨床用藥帶來了很大的挑戰，造成了一些細菌感染性疾病幾乎無藥可治的現狀[17-19]。越南北部水環境中已經檢測到25種抗藥性菌屬[20]。

1.2.2 對水產養殖業的危害 隨著國家的發展，人們的生活水平不斷提高，對水產品的需求量越來越大，水產養殖業的規模也在不斷地擴大。但由于中國近幾年的水產品生產主要為高密度、多品種、集約化的養殖模式，使得養殖過程中產品疾病率上升，很多養殖場為了預防和治療各種疾病，加快水產品生長發育，提高產量和減少經濟損失，而選擇加大用藥甚至盲目用藥，導致飼料添加劑超標使用。磺胺類抗菌藥物因具有高效、廉價、低毒且抗菌譜廣的優點而成為目前水產養殖中用得最多、最廣的抗菌藥物之一[7]，對魚類的癤瘡病、爛鰓病、腸炎病、弧菌病、細菌性敗血病等疾病[8]具有良好的療效。然而，投加的抗菌藥物只有部分被利用，剩余的抗菌藥物大多殘留在水體、沉積物以及水生生物體內，這使得水產養殖過程中藥物殘留的問題更加嚴峻。養殖環境的污染、漁藥與飼料添加劑的濫用、養殖及貯運過程中一些不規范的操作等造成了水產品養殖環境中理化污染、微生物病害及物理危害等現象，嚴重影響了水產品的質量安全[21]；而且低濃度的抗菌藥物環境會對長期生活于其中的水生生物有毒害作用，進而影響生態系統的穩定性[22]。有研究顯示：抗菌藥物可通過食物鏈進行傳遞，并通過食物鏈的傳遞作用進一步影響高級生物，以致破壞整個生態系統平衡[23]。

1.2.3 對人體的危害 水產品主要成分是水、蛋白質、脂肪、磷脂和維生素、無機鹽等，其中尤以豐富的蛋白質含量(15%～25%)而被人類公認為是營養又美味的食品，是與人類生活息息相關的食物之一。但是，磺胺類抗菌藥物在水產養殖過程中的不合理使用，極易產生藥物殘留，人類經常食用有磺胺類藥物殘留的動物性食品，就可能引起磺胺類藥物在體內蓄積，對人體的消化系統、造血系統、腎臟等產生不良影響，具有潛在致突變、致畸、致癌等嚴重風險[17，45]，磺胺二甲基嘧啶就存在使小鼠致癌的可能[46]。此外，磺胺類抗菌藥物還易使人產生過敏反應、變態反應以及激素樣作用[14]。

2 磺胺類抗菌藥物殘留的檢測分析方法

抗菌藥物污染問題已經受到各界的高度關注，水產品作為人們日常主要的食物之一，其質量安全也日益受到關注。水產品中的抗菌藥物殘留具有提取凈化難、污染濃度低的特點，能快速準確地檢測水產品中多種藥物殘留的檢測及分析方法急需被研發。目前抗菌藥物殘留的檢測技術有很多種，最常用的有免疫分析法、微生物法、毛細管電泳法和儀器分析法等。

2.1 免疫學分析法

免疫方法的基本原理是利用抗原抗體特異性結合反應來檢測各種物質(藥物、激素、蛋白質、微生物等)的分析方法。常見的主要有酶聯免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)、熒光免疫分析(fluorescence immunoassay，FIA)、免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography，ICA)等。其中ELISA法由于特異性強、操作簡便的特點成為最為常用的方法之一[47]。用于篩查水中磺胺類抗菌藥物污染的ELISA法已經被Shelver等建立，且檢出限<0.04 μg/L[48]；多種磺胺藥物的快速ELISA檢測方法已經建立，并已初步應用于動物樣品藥物殘留的檢測工作中，對磺胺類藥物表現了較高的敏感性[49]。免疫學分析方法雖具有操作簡便、經濟、靈敏度高等優點，適合現場對大量樣品的快速篩檢工作，但是在操作上也存穩定性不高的缺點，導致易出現假陽性的問題，不適合作確證性試驗。

2.2 微生物法

微生物方法是應用較為廣泛的一種檢測方法，它的基本原理是利用特定菌株與藥物的作用來檢測樣品中抗菌藥物的種類和含量。微生物檢測方法主要有分為亮黑還原法、紙片法、TTC法等[50]。該方法具有直觀性強、成本低、操作簡便等優點，但它的靈敏度和特異性相對較低且操作費時，已經逐漸不能滿足當下各種抗菌藥物殘留的檢測工作[51]。

2.3 毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

2.4 儀器分析法

儀器分析法是依據樣品物質的各種表征特性，包括物理上、化學上的以及生理性質等方面的實驗現象，再通過探頭或傳感器、放大器、分析轉化器等轉換成人體可直接感受的已認識的關于物質成分、含量、分布或結構等信息的分析方法。在抗菌藥物殘留檢測分析領域，國內外目前應用得最多最廣的儀器是各種色譜和質譜，如氣相色譜、液相色譜、高效液相色譜、四極桿質譜儀(Q)、離子阱質譜儀(IT)、三重四級桿質譜儀以及液質聯用儀等。

2.4.1 氣相色譜法(gas chromatography，GC) 氣相色譜法(GC)是色譜法的一種，根據固定相的不同，分為用固體吸附劑作固定相的氣固色譜和用涂有固定液的單體作固定相的氣液色譜。自James和Martin在1952年提出氣液相色譜法后，磺胺類抗菌藥物殘留分析實驗應用氣相色譜法的較為廣泛，主要采用的檢測器為電子捕獲檢測器(ECD)。氣相色譜法在1993年被規定為檢測磺胺類抗菌藥物殘留的國家標準檢測方法。但由于ECD的靈敏度較高，易受多種雜質的影響，使得對樣品前處理、凈化等過程要求較高，對操作人員的專業性要求也比較強，使得氣相色譜法的應用不具有普遍性，且隨著液相色譜法的發展，該方法己逐步被淘汰[56]。

2.4.2 液相色譜法(liquid chromatography，LC)和超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC) 液相色譜檢測技術(LC)就是以液體作為流動相的色譜法，主要檢測器配有：紫外可見光檢測器(UV)、二級陣列檢測器(diode array detector，DAD)、各種質譜儀(MS)等；色譜柱主要選用C8或C18；流動相分為高比例有機相和高比例水相，常用的有乙腈-甲酸、乙腈-乙酸、甲醇-乙酸、甲醇-乙酸銨等。 液相色譜法是獲得國際公認分析磺胺類抗菌藥物殘留的方法，具有測定范圍廣、專一性強、靈敏度高等優點；此外，液相色譜流動相組成、比例以及酸堿度等均可根據待測物質靈活調節，輔助待測物質分離，能夠使許多難揮發、強極性化的待測物質得以測定，彌補了氣相色譜法不能準確檢測分析這些化合物的缺點。但是同樣存在對樣品前處理要求較高的缺點，且儀器化程度高，分析周期長，不適宜進行藥物殘留的快速檢測，所以目前主要用于一些藥物的確證分析[18]。液相色譜法的色譜圖不能直接給出未知物質的定性結果，必須在有已知標準作對照的前提下才能定性，當沒有已知標準對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助紅外法、化學法、質譜法等配合；另外大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質還不能分析，此缺點可用高效液相色譜法克服。

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法是色譜法的另一個重要分支，也是以液體為流動相，不同的是采用高壓輸液系統，將緩沖液、不同極性的單一溶劑或者不同比例的混合溶劑等液體流動相泵入裝有特定固定相的色譜柱中，各成分在柱內被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對樣品的檢測分析。超高效液相色譜法(UPLC)是在高效液相色法的基礎上，通過增加色譜峰容量、分析通量以及提高儀器靈敏度等，使得在其他條件相同的情況下，UPLC能分離的色譜峰量是HPLC的2倍以上。UPLC由于具有分析范圍廣泛、分離效率高、檢測限低、分析時間短、自動化程度高等優點，在現代分析實驗中得到了廣泛應用。Xu等運用液相色譜-熒光檢測器檢測了食品中5種磺胺類抗菌藥物的殘留情況，檢測限范圍0.018～0.033 μg/kg[57]。Blackwell等應用高效液相色譜-紫外檢測器檢測地下水及地表水中的磺胺氯噠嗪、泰樂菌素、土霉素等抗菌藥物的殘留情況，其中磺胺氯噠嗪檢出限低至0.25 μg/L[58]；Casetta等應用高效液相色譜串聯質譜法測定了蜂蜜中磺胺類抗菌藥物殘留情況[59]。

2.4.3 液質聯用技術的發展 液相色譜-質譜聯用技術(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)是以液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統的一種結合方法：樣品物質在液相色譜中經分離并離子化后，被質譜的質量分析器將離子化的碎片按質荷比分開，再經檢測器檢測得到質譜圖。液質聯用充分地利用了色譜和質譜各自的優勢，使得色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜的高靈敏度、高選擇性及能準確定性完美結合起來，提高了對復雜樣品的分離分析能力。近些年色譜和質譜技術都在飛速地進步，如高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜(UPLC)、高分離度快速液相色譜(RRLC)及超快速液相色譜(UFLC)等高性能技術的應用使檢測分析更加高效；不同質譜配有不同的質量分析器，如常用四極桿質譜儀(Q)、離子阱質譜儀(IT)、飛行時間質譜儀(TOF)等。它們的聯合應用使得檢測分析更加準確可靠。目前，色譜-質譜聯用技術已經被廣泛地應用到抗菌藥物的多殘留檢測之中。如陳瑩等建立了同時檢測鰻魚中25種藥物的超高效液相色譜串聯質譜法，包括磺胺類、喹諾酮類和大環內酯類等抗菌藥物，檢測限均在0.1～0.2 μg/kg的范圍內[60]；趙春暉建立了鱸魚、鰻鱺、對蝦、河蟹等組織樣品中抗生素多殘留的液相色譜串聯質譜法，檢測限低于0.3 μg/kg[10]。

液質技術的發展使抗生素殘留檢測分析研究進入了一個全新階段，但同時也存在不足，如對樣品前處理要求較高、對操作人員的專業性較強、質譜譜庫不健全和基質效應問題等。如何對簡化樣品的前處理步驟、如何減小樣品的基質效應、如何提高靈敏度以及減少分析時間，從而建立可同時高效、快速、準確地檢測分析多種類獸藥殘留的方法是今后研究的重點、熱點和難點。

3 磺胺類抗菌藥物在水產品中的殘留情況

近些年水產養殖業中抗菌藥物殘留問題引起了廣泛關注，目前市場上大多數水產養殖系統采用高密度、多品種、集約化的養殖模式，導致抗菌藥物的不合理使用，這不僅可能對水生生物造成不利影響[61]，還可能增加病原菌的抗藥性[62]。不僅如此，這些抗菌藥物的殘留可能聚集在養殖水產品中，通過食物鏈進行傳遞，可能最終會威脅到人類的健康[61，63-64]。然而，水產品由于其高的營養價值和美味的口感，被認為是人類主要的也是最受歡迎的食物之一，這就使水產品中抗菌藥物殘留問題的研究更加棘手。雖然水產品中抗菌藥物殘留的問題日益受到關注，但是關于水產品中抗菌藥物殘留的研究和報道還相對較少。建立高效、快速、準確檢測水產品中抗菌藥物殘留的方法和進行客觀科學的健康殘留風險估測等研究急需開展。

3.1 水產品中磺胺類抗菌藥物的殘留分析

水產品中抗菌藥物殘留的問題近些年由于水生環境的嚴重污染逐漸受到關注，再加上檢測分析儀器設備精密度的限制，對于水產品中抗菌藥物殘留的探究相對較少。目前我國關于水產品中磺胺類抗菌藥物的殘留研究主要集中在廣州地區，且主要集中在海水養殖區；而像長江下游等主要淡水養殖區，這方面的研究還未展開。表1顯示，廣州地區的水產品肌肉中一些常用磺胺類抗菌藥物的殘留量均在最高殘留限量(100 μg/kg)[65]以下，而其肝臟中的抗生素殘留量則相對較高，部分已超出100 μg/kg，這可能要引起高度重視。

表1 不同地區水產品中磺胺類抗生素的殘留情況

3.2 最高殘留限量(maximum residue limits，MRLs)

最高殘留限量指的是食品動物在用藥后產生的存在于食品表面或者食品內部所允許該獸藥殘留的最高量。許多國家及國際組織已經對不同基質(如豬、牛、羊、水產等)中的獸藥殘留規定了最高允許殘留限量(MRLs)，如歐盟MRLs的獸藥和添加劑種類為121種，CAC為57種，美國為87種[68-69]，加拿大為85種，中國為134種，日本多達231種。美國以及歐盟的一些國家明確規定動物組織中磺胺類藥物總含量的MRLs不得超過0.1 mg/kg[70]；日本的“肯定列表制度”中規定，部分磺胺類藥物的殘留量需嚴格執行“一律標準”為 0.01 mg/kg[71]；中國農業部第235號公告中也規定動物性食品中磺胺類藥物的MRLs不得超過100 μg/kg[65]。

3.3 人體健康風險評價的方法

目前，國外環境風險評價方面的研究主要集中在人體健康風險評價和生態風險評價2個方面，一系列的評價規范、準則等的制定，使得一個科學的風險評價體系已經基本形成。其中人體健康風險評價的方法已經基本定型。1983 年美國科學院公布了化學物質的人體健康風險評價4步法：(1)危害鑒別：主要包括鑒定風險源的性質及強度；(2)暴露評價：指的是對人群或者生態系統暴露風險因子時的方式、頻率、強度及時長的描述及評估；(3)劑量-反應分析：暴露與暴露所導致的人群健康或生態系統影響下的因果關系；(4)風險表征：就是利用前3步所獲得的數據，估算某化學物質在不同暴露途徑下所可能產生的健康風險概率、強度以及可接受的風險水平等。統計顯示，較常見的風險在10-6～10-3的范圍。人們生活中食入食品和飲水等引起某種危害的水平在 10-9～10-5的范圍。對于人體健康風險評價，美國環境保護局(USEPA)認可的致癌物的可接受風險閾值為10-5/年，若人的平均壽命按70歲算，則人一生最大可接受致癌風險為 7×10-4；對于非致癌性化學污染物，英國皇家協會、瑞典環境保護局及荷蘭建設環境部等推薦的化學污染物對人體健康危害的最大可接受風險水平為10-6/年，即終生最大可接受風險為7×10-5。人類通過膳食從水產品中攝入的抗菌藥物含量可通過膳食暴露風險評估對其進行粗略的估測，但由于有限的毒理學數據和待商定的各種標準，估測人類通過膳食水產品而引起的抗菌藥物殘留量安全的潛在風險仍然是一個挑戰。目前最常引用的參數標準是最大無作用劑量(maximal no-effective level，MNEL)、最小有作用劑量(minimal effective level，MEL)、每日容許攝入量(acceptable daily intake，ADI)和每日攝入量評估值(estimated daily intake，EDI)等。

3.3.1 最大無作用劑量(MNEL)和最小有作用劑量(MEL) MNEL指在一定時間內按一定途徑或方式，某種外源化學物與機體接觸后，用當前認識水平下的最靈敏的試驗方法和觀察指標，未能觀察到對機體造成任何損害或使機體出現異常反應的最高該化學物的劑量。MEL也稱之為中毒閾值(toxic threshold value)或中毒閾劑量(toxic threshold level)，它指的是一種外源性化學物在一定時間內按一定方式或途徑與機體接觸后使某項靈敏的觀擦指標開始出現異常或使機體開始出現損害現象的最低劑量

3.3.2 每日容許攝入量(ADI) ADI是指人或動物每日直接或間接地攝入某種化學物質后，如食品添加劑、抗生素、農藥等，對人體健康無任何已知不良效應的劑量。ADI值越高，說明該化學物質的毒性越低。ADI=NOEL(最大無作用劑量)/SF(安全因子)，SF一般取100、200；單位一般是mg/kg或g/kg，以相當于人或動物1 kg體質量的毫克數或克數來表示。攝入該化學物質如果在ADI劑量下，則終身不會對其健康造成任何可測量的損害；根據ADI計算出的每種食品中某些化學物的安全添加劑量，保證隨著食品進入人體的化學物質總量低于ADI；例如某化學物質對人體的ADI值為 2 mg/kg，體質量按60 kg算，則人體每日攝入該化學物質在 120 mg 以內是安全無害的。

3.3.3 每日攝入量評估值(EDI) EDI 表示ADI值的百分比，由糧食及農業組織和世界衛生組織推薦使用。根據實驗內容不同，計算方法上有些許差異，如He等采用的計算方法是EDI=C×K/BW，C代表水產品抗生素殘留的平均濃度，K代表平均每人每天食用的水產品量，BW代表人體平均體質量[61]；Chen等采用的計算方法是EDI=Cbiota×Mbiota，Cbiota表示的是所檢測的抗菌藥物在水產品中的最大濃度，Mbiota表示的是一個特定的年齡層的群體每人每天食用的水產品量[72]。

4 展望

當前國內外對整個生態環境中如地下水、地表水、養殖水、廢水、土壤、底泥等的抗菌藥物污染開展了許多研究，但是對水生生物體中抗菌藥物污染的研究還相對較少，無論是檢測方法上還是分析方法上都還不成熟：檢測方法上，水產品中抗菌藥物污染大多數是微量甚至是痕量的，這就要求儀器具有更高的靈敏度、更低的檢測限和更準確的定性定量；分析方法方面，現有的方法還不夠完善，在檢測分析上缺少譜庫，存在一些中間代謝產物無法辨別等問題。我國是水產大國，水產品中抗菌藥物污染檢測分析以及治理技術上的探索仍處于初級階段，保證綠色健康的水產品質量，建立高效準確快速的抗菌藥物檢測分析方法，作出科學健康的膳食風險評估是每個科研工作者應盡的責任，這些問題的解決和系統完善仍需要廣大學者不斷地研究解決。

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